一种分析健脾益肾方治疗上皮间质转化作用机制的方法技术

本发明专利技术涉及药理学技术领域，具体涉及一种分析健脾益肾方治疗上皮间质转化作用机制的方法。所述方法包括以下步骤：筛选健脾益肾方中各味中药的活性成分；再筛选活性成分和上皮间质转化对应的靶标；然后筛选化合物与上皮间质转化的共有靶标并构建蛋白互作网络；利用R软件将共有靶标进行GO生物功能和KEGG通路富集分析取得可视化结果；构建化学成分

【技术实现步骤摘要】
一种分析健脾益肾方治疗上皮间质转化作用机制的方法


[0001]本专利技术涉及药理学
，具体涉及一种分析健脾益肾方治疗上皮间质转化作用机制的方法。

技术介绍

[0002]肾纤维化可导致肾功能进行性丧失，表现为肾固有细胞增殖、肾间质成纤维细胞活化和细胞外基质沉积，是肾功能衰竭最常见的原因。肾纤维化的主要效应细胞是活化的系膜细胞、成纤维细胞和肌成纤维细胞。然而很大一部分间质肌成纤维细胞实际上是通过上皮
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间质转化从肾脏中受影响的肾小管上皮细胞衍生而来的。上皮
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间质转化作为肾纤维化的主要机制之一，也被发现通过多种信号通路促进肾纤维化，最终导致肾功能损害，进而发展为慢性肾病和终末期肾病。尽管现代医学已进行了广泛的研究，但目前的西医治疗策略很难逆转肾纤维化的进展，需要开发一种替代治疗方法来逆转或阻止肾纤维化的进展。
[0003]健脾益肾方是由“玉屏风散”和“四精丸”加减而成。健脾益肾方是在临床中为慢性肾脏病患者开具的处方，其中包括黄芪、山药(怀)、丹参、白术(生)、肉苁蓉、豆蔻、大黄(生)、甘草(炙)8味中药组成，组方采用“二补五通法”，“二补”以“补肾”和“补脾”为主。运用黄芪、白术、山药、肉苁蓉脾肾双补。方中重用黄芪补五脏之气，是大补脾肾之气的重要药物。“五通”则是通大便，通小便，通汗液，通呼吸，通血脉。方中采用大黄、白术、酒苁蓉润肠通便之通大便，黄芪、白术利水之通小便，豆蔻温中化湿行气之通汗液、通呼吸，丹参、大黄活血祛瘀之通血脉，加以炙甘草健脾而调和诸药。综上诸药合用，攻补兼施，共奏健脾益肾、活血化浊之功。
[0004]先前的药物研究表明，健脾益肾方可有效治疗慢性肾病和肾纤维化，有效抑制上皮间质转化，但健脾益肾方成分复杂，作用机制不够明确，限制了其广泛的临床应用。
[0005]中药具有多成分、多靶点、多通道的特点，通过其主要活性成分的协同作用，可以增强机体功能，降低药物毒性，是药物研发的丰富资源。近年来，在中药及其提取物的实验模型和临床研究中，中医药在防治肾纤维化方面取得了很大进展，有效抑制了上皮间质转化的发展。网络药理学是一种基于系统生物学的理论，借助于数据库在分子水平上来预测药物作用机制的一种方法，近年来在现代中医研究中得到普遍应用。它强调信号通路的多途径调控，符合中药多成分、多靶点的特点，成为中医药分子水平研究的有效新途径。
[0006]因此，现有技术中需要建立一种网络药理学方法探究健脾益肾方治疗上皮间质转化的作用机制并验证该方法的准确性的方法。

技术实现思路

[0007]本专利技术所要解决的技术问题是：提供一种基于分析健脾益肾方治疗上皮间质转化作用机制的方法，通过网络药理学结合体内实验验证健脾益肾方治疗上皮间质转化的作用机制，将体内药效学的实验结果与网络药理学获得的关键相关通路进行对应，确定其潜在的分子机制，为后续的开发应用提供参考。
[0008]为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：提供一种分析健脾益肾方治疗上皮间质转化作用机制的方法，包括如下步骤：
[0009]S1、获取健脾益肾方的药物活性成分；
[0010]S2、分别获取所述健脾益肾方中活性成分及上皮间质转化疾病的对应靶标，将健脾益肾方中活性成分及上皮间质转化疾病的对应靶标分别转换为对应的基因名称；
[0011]S3、将健脾益肾方中活性成分与上皮间质转化的共有基因在STRING平台中构建蛋白互作网络，其中蛋白相互作用的评分设置为0.9，隐藏网络中与其它基因没有关联的节点基因，然后将String_interactions.tsv文件导出，输入Cytoscape 3.7.1软件进行可视化展示；
[0012]S4、将步骤S3所得健脾益肾方中活性成分与上皮间质转化的共有基因导入VENNY 2.1网站中绘制韦恩图；然后采用R软件对共有基因进行GO和KEGG信号通路的富集分析，结果分别以气泡图和柱状图表示；
[0013]S5、根据富集分析结果，通过与信号通路有相关联的靶标及其活性成分，构建活性成分
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共有靶标
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信号通路网络，系统解释健脾益肾方对上皮间质转化的作用机制并筛选核心靶点。
[0014]进一步的，上述的分析健脾益肾方治疗上皮间质转化作用机制的方法中，步骤S1具体为：采用Q
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TOF/MS化学表征获取成分，并在中药系统药理数据库和分析平台、中医药整合药理学研究平台v2.0中筛选健脾益肾方中各味中药的活性成分，筛选条件为口服生物利用度≥30％且类药性≥0.18。
[0015]进一步的，上述的分析健脾益肾方治疗上皮间质转化作用机制的方法中，步骤S2具体为：在中药系统药理数据库和分析平台、中医药整合药理学研究平台v2.0、Swiss Target Prediction数据库中查询所述健脾益肾方中活性成分对应的靶标；在OMIM、GeneCards和Drugbank数据库中以epithelial
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mesenchymal transition为关键词查询上皮间质转化疾病对应的靶标，通过UniProt数据库将将所有靶标转换为基因名称。
[0016]进一步的，上述的分析健脾益肾方治疗上皮间质转化作用机制的方法中，步骤S5中构建活性成分
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共有靶标
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信号通路网络为：将健脾益肾方中活性成分与上皮间质转化的共有基因及其相关的信号通路和活性成分导入Cytoscape 3.7.1软件中Network Analyzer插件进行网络分析，并获取网络拓扑参数，包括度中心性、接近中心性、中介中心性三者。
[0017]进一步的，上述的分析健脾益肾方治疗上皮间质转化作用机制的方法中，步骤S5中筛选核心靶点的标准为：度中心性、接近中心性、中介中心性均大于该网络平均值的靶标或活性成分节点。
[0018]进一步的，上述的分析健脾益肾方治疗上皮间质转化作用机制的方法中，还包括如下动物实验验证步骤：
[0019]S6、健脾益肾方的制备和动物分组及给药；
[0020]S7、动物造模方法
[0021]以腹腔注射10％水合氯醛麻醉动物，常规消毒铺巾，从右背部切口，打开腹腔，静脉夹夹住肾蒂后用高频电刀切除右肾上下极，切除2/3，止血后复位肾脏；2周后进行第2次手术，切除左侧肾脏，假手术组采取同样步骤打开腹腔，暴露肾脏后复位，避免牵拉肾脏；
[0022]S8、马松染色
[0023]肾脏用10％中性甲醛固定，石蜡包埋切片，采用马松染色评价肾脏病理变化；
[0024]S9、免疫印迹实验
[0025]用RIPA裂解缓冲液裂解肾脏组织，采用BCA试剂盒进行蛋白定量，加载等量的裂解物并通过10％SDS
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聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转移到PVDF膜上，室温下在5％脱脂牛奶中封闭2小时后，将PVDF膜与各种一抗在4℃孵育过夜，其中包括步骤S4富集分析的信号通路的蛋白，然后，将PVDF膜在HRP偶联的二抗中室本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种分析健脾益肾方治疗上皮间质转化作用机制的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、获取健脾益肾方的药物活性成分；S2、分别获取所述健脾益肾方中活性成分及上皮间质转化疾病的对应靶标，将健脾益肾方中活性成分及上皮间质转化疾病的对应靶标分别转换为对应的基因名称；S3、将健脾益肾方中活性成分与上皮间质转化的共有基因在STRING平台中构建蛋白互作网络，其中蛋白相互作用的评分设置为0.9，隐藏网络中与其它基因没有关联的节点基因，然后将String_interactions.tsv文件导出，输入Cytoscape 3.7.1软件进行可视化展示；S4、将步骤S3所得健脾益肾方中活性成分与上皮间质转化的共有基因导入VENNY 2.1网站中绘制韦恩图；然后采用R软件对共有基因进行GO和KEGG信号通路的富集分析，结果分别以气泡图和柱状图表示；S5、根据富集分析结果，通过与信号通路有相关联的靶标及其活性成分，构建活性成分
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共有靶标
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信号通路网络，系统解释健脾益肾方对上皮间质转化的作用机制并筛选核心靶点。2.根据权利要求1所述的分析健脾益肾方治疗上皮间质转化作用机制的方法，其特征在于，步骤S1具体为：采用Q
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TOF/MS化学表征获取成分，并在中药系统药理数据库和分析平台、中医药整合药理学研究平台v2.0中筛选健脾益肾方中各味中药的活性成分，筛选条件为口服生物利用度≥30％且类药性≥0.18。3.根据权利要求1所述的分析健脾益肾方治疗上皮间质转化作用机制的方法，其特征在于，步骤S2具体为：在中药系统药理数据库和分析平台、中医药整合药理学研究平台v2.0、Swiss Target Prediction数据库中查询所述健脾益肾方中活性成分对应的靶标；在OMIM、GeneCards和Drugbank数据库中以epithelial
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mesenchymal transition为关键词查询上皮间质转化疾病对应的靶标，通过UniPr...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈剑平，赵元，李顺民，卢锦华，张尚斌，陈秋谷，黄诗莹，
申请(专利权)人：深圳市中医院，
类型：发明
国别省市：