一种评价甘蓝型油菜蜂花粉致敏性的方法技术

本发明专利技术涉及食品技术领域，具体涉及一种基于过氧化氢酶（Catalase）和脂肪酶（Lipase）特征肽段指标评价甘蓝型油菜蜂花粉致敏性的方法。本发明专利技术首次提出以过氧化氢酶（Catalase）和脂肪酶（Lipase）特征肽段作为甘蓝型油菜蜂花粉的致敏性评价指标，并据此提供具体评价方法。本发明专利技术所述的评价方法能够快速、准确地对甘蓝型油菜蜂花粉的致敏性进行评价，为相关蜂花粉产品的标准化生产和品质控制提供评估依据。据。据。

A method for evaluating bee pollen sensitization of Brassica napus

【技术实现步骤摘要】
一种评价甘蓝型油菜蜂花粉致敏性的方法


[0001]本专利技术涉及食品
，具体涉及一种基于过氧化氢酶（Catalase）和脂肪酶（Lipase）特征肽段评价甘蓝型油菜蜂花粉致敏性的方法。

技术介绍

[0002]甘蓝型油菜蜂花粉是一种世界范围内产量较大、应用范围较广的蜂花粉品种，富含多种营养、活性成分，具有极高的食用和药用价值，目前在食品、保健品、药品，以及畜牧养殖行业的应用逐渐扩大。然而，食用甘蓝型油菜蜂花粉随即带来的过敏问题也逐渐引起人们的关注。数据显示，部分易感人群在食用甘蓝型油菜蜂花粉后会产生临床过敏症状。开发便捷、高效、准确的蜂花粉致敏性评价方法对蜂花粉的食用安全防控至关重要。
[0003]现有技术已开发了对蜂花粉过敏原的鉴定方法，并从油菜蜂花粉中鉴定得到5种致敏蛋白，包括前纤维蛋白（Profilin）、扩张蛋白（Expansin）、醇溶谷蛋白（Prolamin）、油质蛋白（Oleosin B2）和谷氧还蛋白（Glutaredoxin），为蜂花粉的致敏性研究奠定了基础。
[0004]此外，现有技术还开发了对不同类型蜂花粉致敏性的评价方法，例如，以油质蛋白（Oleosin B2）和谷氧还蛋白（Glutaredoxin）作为指标评价天然油菜蜂花粉和发酵油菜蜂花粉的致敏性；以胱抑素（Cystatin）和前纤维蛋白（Profilin）作为指标评价天然油菜蜂花粉和破壁油菜蜂花粉的致敏性。
[0005]相比于天然油菜蜂花粉、发酵油菜蜂花粉、破壁油菜蜂花粉等类型油菜蜂花粉，甘蓝型油菜蜂花粉的植物来源单一且明确，是蜜蜂采自于Brassica napus植物花粉而制成。由于其具有专属性的特点，现有其它类型的油菜蜂花粉的致敏性评价方法用于评估甘蓝型油菜蜂花粉的致敏性时，受到的干扰性大，准确度不高，制约了相关产品的标准化生产和品质控制。
[0006]有鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0007]本专利技术针对现有技术中缺乏针对甘蓝型油菜蜂花粉致敏性评价方法的问题，提出一种有效的评价方法。
[0008]本专利技术第一方面提供以过氧化氢酶（Catalase）和脂肪酶（Lipase）特征肽段作为蜂花粉致敏性评价指标的新应用；所述蜂花粉为甘蓝型油菜蜂花粉。
[0009]过氧化氢酶（Catalase）是催化过氧化氢分解成氧和水的酶，过氧化氢酶的活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力均有关系，可以根据这种酶的活性水平判断植物是否受到氧化损伤。基于这一特定，过氧化氢酶通常被用于食品工业中除去用于制造奶酪的牛奶中的过氧化氢。此外，过氧化氢酶也常被用于食品包装中，以防止食物被氧化。
[0010]而脂肪酶（Lipase）则通常用于催化分解油脂类物质生成糖类，以提供生物体所必需的养料和能量。
[0011]然而本专利技术研究人员在对油菜蜂花粉的研究中，首次鉴定出其中含有致敏原过氧
化氢酶（Catalase）和脂肪酶（Lipase）特征肽段，并基于此提出以过氧化氢酶（Catalase）和脂肪酶（Lipase）特征肽段作为评价甘蓝型油菜蜂花粉致敏性的指标，可显著提高其致敏性评价的准确性。而现有技术中从未公开过氧化氢酶和脂肪酶的特征肽段具有致敏性，且可用于作为致敏性评价的指标的
技术实现思路
，因此，本申请对于二者的新应用是非显而易见的。
[0012]本专利技术第二方面提供上述蜂花粉致敏性的评价方法。通过该方法可以快速、准确的评价此类蜂花粉是否具有致敏性，为此类蜂花粉的标准化生产和品质控制提供评估依据。
[0013]本专利技术提供的上述蜂花粉致敏性的评价方法，包括：以过氧化氢酶（Catalase）和脂肪酶（Lipase）特征肽段为评价指标，利用蛋白组学技术检测蜂花粉蛋白提取物中过氧化氢酶（Catalase）和脂肪酶（Lipase）的特征肽段，根据质谱检测及分析结果评价样品的致敏性；所述蜂花粉为甘蓝型油菜蜂花粉。
[0014]进一步地，本专利技术所述的评价方法中，在所述蛋白组学技术检测实施前，对蜂花粉蛋白提取物进行酶切处理；所述酶切处理使用的酶为质谱级胰蛋白酶；所述蛋白提取物中蛋白质量与胰蛋白酶的质量比为（30
‑
100）：1；优选50:1。研究表明，通过控制胰酶用量，起到充分酶切蜂花粉蛋白提取物的作用，同时又避免过度酶切而影响鉴定结果的准确性。所述酶切处理的条件为：37℃下孵育12
‑
14 h。
[0015]进一步地，所述蛋白组学技术的检测条件为：所述检测采用纳升级液相色谱仪串联组合型质谱仪进行；EASY
‑
nLC 1000纳升级液相色谱仪串联LTQ
‑
Orbitrap Elite组合型质谱仪（Thermo Fisher Scientific，USA）；富集柱（100 μm
ꢀ×ꢀ
2 cm，5 μm）和分析柱（75 μm
ꢀ×ꢀ
15 cm，3 μm，100
ꢀÅ
）均为Thermo Fisher Scientific公司生产的反相 C18柱；色谱条件设置如下：流动相流速为350 nL/min，流动相A为 0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液；流动相洗脱梯度设置如下：表1质谱条件设置如下：一级全扫描：离子源为电喷雾离子源（ESI），喷雾电压为2.3 kV，离子传输管温度为275℃，S
‑
Lens射频为55%，分辨率为60000，扫描范围为 300
‑
8000 m/z。
[0016]二级扫描是在一级扫描基础上进行的，选取前20个离子信号强度最强的母离子。二级扫描参数：分辨率为15000，隔离窗口为2 m/z，碎裂模式为高能碰撞离子解离（HCD），能量为30 %。
[0017]通过上述质谱检测条件的优化，起到提高质谱检测灵敏度和准确度的作用。
[0018]进一步地，本专利技术所述的评价方法中，所述质谱检测及分析还包括：根据蛋白质组学检测获得的质谱数据，利用Uniprot蛋白质数据库检索获得蛋白质氨基酸序列；根据蛋白质氨基酸序列，利用AllergenOnline致敏蛋白数据库进行蛋白质序列同源性比对，获得过氧化氢酶（Catalase）和脂肪酶（Lipase）的特征肽段；通过DNAStar软件根据过氧化氢酶（Catalase）和脂肪酶（Lipase）的一级序列进行抗原表位分析。
[0019]进一步地，为了提高上述蜂花粉致敏性评价方法的准确性，本专利技术所述的评价方法还包括：利用斑点免疫印迹技术进行相互验证；所述斑点免疫印迹技术包括：蛋白提取、蛋白上样、孵育抗体、膜显色反应。
[0020]所述斑点免疫印迹技术具体步骤如下：（1）利用植物蛋白提取试剂盒对不同处理组的蜂花粉粉末进行蛋白提取，然后利用二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒测定各组样品蛋白提取液的蛋白浓度；（2）准备一张5 cm
×
5 cm的硝化纤维膜，将4组样品点在膜上，保证各组样品蛋白上样量相同，为20~100 μg，然后将膜晾干；（本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.过氧化氢酶和脂肪酶特征肽段在蜂花粉致敏性评价中作为评价指标的应用；所述蜂花粉为甘蓝型油菜蜂花粉。2.一种蜂花粉致敏性的评价方法，其特征在于，以过氧化氢酶和脂肪酶特征肽段作为评价指标；所述蜂花粉为甘蓝型油菜蜂花粉。3.根据权利要求2所述的蜂花粉致敏性的评价方法，其特征在于，利用蛋白组学技术检测蜂花粉样品的蛋白提取物中过氧化氢酶和脂肪酶的特征肽段，根据质谱检测及分析结果评价蜂花粉样品的致敏性。4.根据权利要求3所述的蜂花粉致敏性的评价方法，其特征在于，在所述蛋白组学技术检测实施前，对蜂花粉蛋白提取物进行酶切处理；所述酶切处理使用的酶为质谱级胰蛋白酶；所述蛋白提取物中蛋白质量与胰蛋白酶的质量比为（30
‑
100）：1。5.根据权利要求4所述的蜂花粉致敏性的评价方法，其特征在于，所述蛋白组学技术的检测条件为：所述检测采用纳升级液相色谱仪串联组合型质谱仪进行；富集柱和分析柱均为反相C18柱；色谱条件设置如下：流动相流速为350 nL/min，流动相A为 0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液；流动相洗脱梯度...

【专利技术属性】
技术研发人员：李强强，周恩宁，尹舒婷，陶宇逍，吴黎明，薛晓锋，
申请(专利权)人：中国农业科学院蜜蜂研究所，
类型：发明
国别省市：