从人多能干细胞制备间充质干细胞的方法及由此制备的间充质干细胞技术

本发明专利技术涉及一种从人多能干细胞制备间充质干细胞的方法，更具体地说，涉及一种制备间充质干细胞的方法，其中在无异种和无血清的环境中制备从一定大小的拟胚体分化的间充质干细胞，由此所述间充质干细胞表现出更高的安全性并长期保持其自身特性。根据本发明专利技术的从人多能干细胞制备间充质干细胞的方法采用无滋养细胞、无异种、无血清的培养环境，以解决外来动物源性材料的污染问题，并允许制备高度安全的间充质干细胞。此外，该方法利用球状拟胚体形成形状和大小均匀的成熟拟胚体，从而提高了对间充质干细胞的分化效率，并且即使在长期传代培养(例如20次或更多次传代)后仍表现出稳定保持间充质干细胞特性的优异效果，通过该传代可大量制备人多能干细胞来源的间充质干细胞。因此，本发明专利技术有利于将安全性和效率极佳的细胞治疗剂商业化。治疗剂商业化。治疗剂商业化。

Method for preparing mesenchymal stem cells from human pluripotent stem cells and mesenchymal stem cells prepared therefrom

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】从人多能干细胞制备间充质干细胞的方法及由此制备的间充质干细胞


[0001]本专利技术涉及一种从人多能干细胞制备间充质干细胞(MSC)的方法，更具体地，涉及一种制备间充质干细胞的方法，其中所述间充质干细胞表现出更高的安全性并长期保持其自身特性，甚至在利用无异种(xeno
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free)和无血清的环境多次传代培养制备间充质干细胞和球形拟胚体以形成形状和大小均匀的成熟拟胚体时也是如此。

技术介绍

[0002]干细胞是可以分化成构成生物组织的各种细胞的细胞，统称可以从胚胎、胎儿和成人的各个组织中获得的处于预分化阶段的未分化细胞。干细胞通过分化刺激(环境)分化成特定的细胞，通过细胞分裂可以复制(自我更新)与自身相同的细胞，因此具有增殖(扩张)的特性，这与分化完成和细胞分裂终止的细胞不同，并且其特征在于具有分化可塑性，因为干细胞可以在不同环境下或其他分化刺激下分化成不同的细胞。
[0003]干细胞根据其分化能力可分为多能干细胞(pluripotent)、专能干细胞(multipotent)和单能干细胞。多能干细胞是具有分化成所有细胞的潜能的多能细胞，胚胎干细胞(ESC)、经诱导的多能干细胞(iPSC)等对应于多能干细胞。成体干细胞可以作为多能和/或单能干细胞的示例。
[0004]胚胎干细胞是由胚泡(是胚胎发育的早期阶段)的内部细胞团形成的，具有分化成所有细胞的潜能，因此可以分化成任何组织细胞。胚胎干细胞是永生的，它们可以在未分化状态下培养，并且它们具有可传递给下一代的性状，因为它们可以制备与成体干细胞不同的生殖细胞(Thomson et al,Science,282:1145
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1147,1998；Reubinoff et al,Nat Biotechnol,18:399
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404,2000)。
[0005]人类胚胎干细胞是通过在人类胚胎形成过程中仅分离和培养内部细胞团来制备的，目前，世界范围内制备的人类胚胎干细胞是从体外受精治疗后留下的冷冻胚胎获得的。尽管已经进行了各种尝试以使用可以分化成所有细胞的多能人类胚胎干细胞作为细胞治疗剂，但癌症的风险和免疫排斥的高屏障仍未得到完全控制。
[0006]同时，经诱导的多能干细胞(iPSCs)，包括在多能干细胞的概念中，是已经完全分化的成体细胞以各种方式去分化并恢复到多能干细胞状态(即分化的初始期)的细胞。迄今为止，据报道，去分化细胞在基因表达和分化能力方面表现出与胚胎干细胞(是多能干细胞)几乎相同的特征。然而，即使是iPSC，免疫排斥的风险可以用自体细胞排除，但癌症的风险仍然是一个有待解决的问题。
[0007]作为克服这个问题的替代方案，已经提出了没有癌症风险以及具有免疫调节功能的间充质干细胞。据报道，间充质干细胞是能够分化成脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌细胞、神经细胞和心肌细胞的多能细胞，并且还具有调节免疫应答的功能。尽管间充质干细胞可以从各种组织中分离和培养，但要明确定义间充质干细胞并不容易，因为每种来源的能力和细胞表面标志物略有不同。然而，当干细胞可以分化成骨细胞、软骨细胞和肌细胞，呈
纺锤形，并表达CD73(+)、CD105(+)、CD34(
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)和CD45(
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)等基本细胞表面标志物时，这些干细胞通常被定义为间充质干细胞。
[0008]此外，为了将间充质干细胞用作细胞治疗剂，应满足再生医学和/或细胞疗法领域所需的最低细胞数(约1X109)，当即使考虑到确定适当条件和确定标准的实验，所需的细胞数量也将进一步增加。因此，要从现有的各种来源的间充质干细胞中提供这一数量，在体外实验中至少需要传代10次，在这种情况下，细胞会老化和改变，因此间充质干细胞可能不再适于实现作为细胞治疗剂的目标。毕竟，应用于临床试验的细胞和进行质量评估的细胞不可避免地不同，因此存在一个缺点，即不能排除在验证后形成过程中出现的风险。因此，为了将间充质干细胞用作细胞治疗剂，重要的是即使长时间重复传代培养也保持间充质干细胞的特性而不被修饰。
[0009]作为这些成体来源的间充质干细胞的替代方案，已经提出了一种诱导人多能干细胞分化为间充质干细胞的方法。然而，迄今为止已知的方法是昂贵的，并且具有缺点，例如由特定细胞因子(例如，BMP)诱导的过程，这需要控制具有异种病原体风险的异种滋养细胞的浓度或诱导，又例如使用胎牛血清(FBS)。相关技术中诱导人多能干细胞向间充质干细胞分化的方法(WO 2011052818)存在通过使用滋养细胞而引入外来细胞的可能性，因为人多能干细胞是在异种滋养细胞上培养的，这可能是人类多能干细胞培养过程中的异种病原体问题。此外，由于担心在多能干细胞培养过程中使用牛血清或胎牛血清等动物源性血清引起人畜共患感染，因此有必要改进一种无异种和无血清的培养方法，使得在未来开发细胞治疗剂时不使用外来动物血清。
[0010]因此，本申请专利技术人为了解决与干细胞安全性和干细胞大规模生产有关的问题，以便将从人多能干细胞分化得到的间充质干细胞作为细胞治疗剂商品化，进行了深入研究，结果确认了，细胞安全性通过无异种和无血清环境而最大化，球形拟胚体可用于形成形状和大小均匀的成熟拟胚体，并且由其诱导分化的间充质干细胞甚至在重复传代培养后仍长时间保持间充质干细胞的特性，由此完成本专利技术。

技术实现思路

[0011]技术问题
[0012]本专利技术的一个目的是，提供一种通过制备间充质干细胞来制备来源于人类多能干细胞的间充质干细胞作为细胞治疗剂的方法，其中由外来细胞和外来动物来源的材料的污染引起的安全性问题得到解决，并且即使在重复传代培养后，间充质干细胞的特性也得以长期保持。
[0013]本专利技术的另一个目的是，提供由该方法制得的间充质干细胞和使用其的细胞治疗剂。
[0014]技术方案
[0015]为实现上述目的，本专利技术提供了一种由人多能干细胞制备维持长期传代培养稳定性的间充质干细胞的方法，该方法包括：
[0016](a)在不含异种滋养细胞的无血清多能干细胞培养基中培养人多能干细胞以获得人多能干细胞集落并从集落中分离人多能干细胞；
[0017](b)通过将分离的多能干细胞悬浮在拟胚体形成培养基中，形成单个的球状拟胚
体，然后对分离的多能干细胞进行培养以使多能干细胞聚集；
[0018](c)通过将拟胚体悬浮培养在拟胚体成熟培养基中，形成成熟拟胚体；
[0019](d)通过将拟胚体贴壁培养在无异种和无血清的间充质干细胞培养基中，诱导分化为间充质干细胞；和
[0020](e)使分化的间充质干细胞在无异种和无血清的间充质干细胞培养基中增殖和培养，同时保持间充质干细胞的特性。
[0021]本专利技术还提供由该方法制得的从人多能干细胞分化和诱导的间充质干细胞、以及包括所述间充质干细胞的细胞治疗剂。
附图说明
[0022]图1是现有多能干细胞来源间充质干细胞制备法(WO 2011052818)和本专利技术多能干细胞来源间充质干本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种从人多能干细胞制备间充质干细胞的方法，该方法包括以下步骤：(a)在不含异种滋养细胞的无血清多能干细胞培养基中培养人多能干细胞以获得人多能干细胞集落并从所述集落中分离人多能干细胞；(b)通过将分离的多能干细胞悬浮在拟胚体形成培养基中形成单个球状拟胚体，然后培养分离的多能干细胞以使多能干细胞聚集；(c)通过在拟胚体成熟培养基中悬浮培养所述拟胚体形成成熟的拟胚体；(d)通过在无异种和无血清的间充质干细胞培养基中贴壁培养所述拟胚体来诱导分化为间充质干细胞；和(e)在无异种和无血清的间充质干细胞培养基中增殖和培养分化的间充质干细胞，同时保持间充质干细胞的特性。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述人多能干细胞为胚胎干细胞或诱导多能干细胞。3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述人多能干细胞处于未分化状态。4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)中所述人多能干细胞在包被有选自由玻连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白、基质胶和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖组成的组的材料的培养容器中培养。5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)中用于培养人多能干细胞的所述无血清培养基为TeSR
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Essential 8(TeSR
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E8)培养基、TeSR
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2培养基或StemACS iPS
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Brew XF人培养基。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)中的拟胚体通过悬滴培养形成，或者采用V型管、圆形96孔板或锥形管培养。7.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)中所述拟胚体形成培养基是Aggrewell EB形成培养基、Gibco Essential 6培养基、CTS Essential 6培养基或TeSR
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E6培养基。8.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(b)中所述培养进行18小时至30小时。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(c)中所述拟胚体成熟培养基为碱性培养基，包括敲除血清替代物(KSR)、非必需氨基酸(NEAA)和β
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巯基乙醇。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(c)中所述基础培养基为DMEM/F12、αMEM、Ham's F12培养基或DMEM。11.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)中所述悬浮培养进行10至18天。12.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)中获得的所述成熟拟胚体具有350至450μm的平均大小。13.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(d)和(e)中所述间充质干细胞培养基是包含L
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谷氨酰胺的无异种和无血清培养基。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述无异种和无血清培养基是Stem...

【专利技术属性】
技术研发人员：金奇男，崔丞铉，吴宝灆，崔美敬，曹准权，
申请(专利权)人：株式会社大熊制药，
类型：发明
国别省市：