一种高含量油菜素内酯番茄植株的培育方法技术

本发明专利技术公开了一种高含量油菜素内酯番茄植株的培育方法，属于生物技术领域。本发明专利技术提供了CPK27基因作为负调控因子在提高植物油菜素内酯含量中的应用，所述CPK27基因的蛋白编码区的核苷酸序列如SEQID NO.1所示或与SEQ ID NO.1所示序列具有至少70％同源性且编码的蛋白在功能上等价。本发明专利技术首次公开CPK27基因在提高植物油菜素内酯类物质中的新用途，通过基因编辑技术缺失CPK27基因功能，可显著提高植物油菜素内酯类物质含量。本发明专利技术为培育高含量油菜素内酯类物质和具备广谱逆境抗性的番茄品种提供了重要的基因资源。茄品种提供了重要的基因资源。茄品种提供了重要的基因资源。

A cultivation method of tomato plants with high content of brassinolide

【技术实现步骤摘要】
the key biosynthetic gene DWARF4 in Arabidopsis thaliana.Plant Cell2010，22:1161
–
1173)。
[0007]植物体内油菜素内酯类物质的合成受到多种因素的影响，调控合成的其他元件急需深入挖掘。CPK是植物一种钙离子依赖型蛋白激酶，其在调控油菜素内酯合成过程中的作用鲜有报道，因此，基于番茄CPK27基因进而创制高含量油菜素内酯类物质的番茄植株具有理论和实际应用价值。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的是提供一种可调控植物内源油菜素内酯类物质合成的基因，通过基因改造达到提高植物内源油菜素内酯类物质合成的目的，为培育高含量油菜素内酯类物质作物种质提供依据。
[0009]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0010]本专利技术提供了CPK27基因作为负调控因子在提高植物油菜素内酯含量中的应用，所述CPK27基因的蛋白编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或与SEQ ID NO.1所示序列具有至少70％同源性且编码的蛋白在功能上等价。
[0011]核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的CPK27基因位于番茄的第11染色体上，编码一种钙离子依赖型蛋白激酶，属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，由N段可变结构域、蛋白激酶域、自我抑制结构域和Ca
2+
结合域组成，当与钙离子结合时，该蛋白被激活。
[0012]所述应用包括：利用生物学技术使得所述CPK27基因功能缺失，进而提高植物内源油菜素内酯类物质的含量。
[0013]具体的，利用基因突变、基因敲除、基因干扰或基因沉默技术导致所述CPK27基因的表达降低或缺失，从而获得高含量油菜素内酯的突变体植株。
[0014]进一步的，所述油菜素内酯包括油菜素甾酮(Castasterone,CS)和芸薹甾内酯(Brassinolide,BL)。
[0015]进一步的，所述CPK27基因编码的蛋白质负调控油菜素甾酮合成基因CYP85A1(基因登录号为：Solyc02g089160)的表达。
[0016]本专利技术通过基因编辑技术制备得到定点编辑CPK27基因的番茄cpk27缺失突变体植株。研究发现，番茄CPK27基因突变后，CYP85A1基因表达量显著提高，番茄油菜素甾酮和芸薹甾内酯含量显著提高；因此，敲除番茄CPK27基因有利于提高番茄内源油菜素内酯类物质含量，可用于创制高含量油菜素内酯类物质的番茄种质。
[0017]进一步的，所述植物为番茄。
[0018]番茄CPK27基因编码的蛋白质由533个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0019]本专利技术还提供了一种提高番茄植株内源油菜素内酯含量的培育方法，包括以下步骤：
[0020](1)在番茄CPK27基因的蛋白编码区选取含有PAM结构的靶标片段，以靶标片段PAM结构前20个碱基为依据，进行引物设计，构建CRISPR/Cas9载体；所述番茄CPK27基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
[0021](2)构建含步骤(1)所述CRISPR/Cas9载体的农杆菌基因工程菌；
[0022](3)将步骤(2)所述基因工程菌转化番茄子叶，获得不含外源Cas9蛋白且靶标序列发生变异的稳定遗传的纯合突变体株系。
[0023]进一步的，所述靶标片段PAM结构前20个碱基如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。
[0024]进一步的，构建CRISPR/Cas9载体的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示，或者如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示。
[0025]本专利技术具有的有益效果：
[0026](1)本专利技术首次公开CPK27基因在提高植物油菜素内酯类物质中的新用途，通过基因编辑技术缺失CPK27基因功能，可显著提高植物油菜素内酯类物质含量。本专利技术为培育高含量油菜素内酯类物质和具备广谱逆境抗性的番茄品种提供了重要的基因资源。
[0027](2)本专利技术利用基因编辑技术提供了一种高含量油菜素内酯类物质番茄种质的培育方法，与转基因技术相比，不会引入外源基因，并得到了高含量油菜素内酯类物质番茄纯合植株。
附图说明
[0028]图1为油菜素内酯类物质合成途径中最后两个步骤反应式，其中6
‑
deoxocastasterone(6
‑
deoxoCS)在CYP85A1基因编码的酶作用下，转化为有生物活性的油菜素甾酮(Castasterone，CS)，并进一步合成芸薹甾内酯(Brassinolide，BL)。
[0029]图2为番茄cpk27缺失突变体T2代(纯合、不含外源Cas9片段)的核酸序列和蛋白序列与野生型番茄的比较，其中，番茄cpk27有两种突变类型，在sgRNA的位置分别插入了碱基A和T，导致编码的蛋白质提前终止于第140位氨基酸位置；对照代表野生型番茄，cpk27#2、cpk27#6分别代表突变体植株的两种株系。
[0030]图3为野生型番茄和cpk27缺失突变体正常环境下的生长表型，其中(A)为植株照片，从左到右依次为对照、cpk27#2、cpk27#6，可以看出，突变体植株的株高显著高于野生型番茄；(B)为植株高度比较图，小写字母a，b代表不同植株间在5％水平上的差异显著，所用统计方法为Turkey
’
s test。
[0031]图4为野生型番茄和cpk27缺失突变体中CS的含量，小写字母a，b代表不同植株间在5％水平上的差异显著，所用统计方法为Turkey
’
s test。
[0032]图5为野生型番茄和cpk27缺失突变体中BL的含量，小写字母a，b代表不同植株间在5％水平上的差异显著，所用统计方法为Turkey
’
s test。
[0033]图6为CYP85A1基因在野生型番茄和cpk27缺失突变体中的表达量，可以看出，野生型番茄的CYP85A1基因表达量远远低于cpk27缺失突变体。小写字母a，b代表不同植株间在5％水平上的差异显著，所用统计方法为Turkey
’
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具体实施方式
[0034]下面结合具体实施例对本专利技术做进一步说明。以下实施例仅用于说明本专利技术，不用来限制本专利技术的适用范围。在不背离本专利技术精神和本质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本专利技术的范围。
[0035]下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
[0036]下述实施例中采用的番茄材料为常规野生型番茄品种Condine Red。
[0037]实施例1：含2个特异sgRNA的CRISPR/Cas9载体的构建
[0038]在SGN网站https://solgenom本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.CPK27基因作为负调控因子在提高植物油菜素内酯含量中的应用，其特征在于，所述CPK27基因的蛋白编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或与SEQ ID NO.1所示序列具有至少70％同源性且编码的蛋白在功能上等价。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括：利用生物学技术使得所述CPK27基因功能缺失，进而提高植物内源油菜素内酯类物质的含量。3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述油菜素内酯包括油菜素甾酮和芸薹甾内酯。4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述CPK27基因编码的蛋白质负调控油菜素甾酮合成基因CYP85A1的表达。5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物为番茄。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述CPK27基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。7.一种提高番茄内源油菜素内酯含量的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)在番...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡璋健，朱常安，吴鑫怡，张敏，敬北宇，马洪雪，喻景权，
申请(专利权)人：浙江大学山东临沂现代农业研究院，
类型：发明
国别省市：