一种提高博落回中血根碱含量的方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种提高博落回中血根碱含量的方法及应用。通过沉默博落回中的McSMT基因表达或者敲除McSMT基因，提高博落回中血根碱含量。本发明专利技术采用CRISPR/Cas9基因编辑体系敲除McSMT基因，用于培育提高血根碱含量的博落回新种质。主要针对目前博落回传统育种无法快速获得高血根碱含量种质材料的问题，首次在博落回植物应用基因编辑技术获得具有重要应用价值的高血根碱博落回种质材料。用价值的高血根碱博落回种质材料。用价值的高血根碱博落回种质材料。

【技术实现步骤摘要】
一种提高博落回中血根碱含量的方法及应用


[0001]本专利技术属于博落回种质资源研究
，具体涉及一种提高博落回中血根碱含量的方法及应用。

技术介绍

[0002]博落回[Macleaya cordata(Willd.)R.Br.]提取物中以血根碱为主的苄基异喹啉类生物碱在养殖和食品安全领域有着非常重要的作用，已作为饲用抗生素的天然来源替代品广泛应用于畜禽水产等养殖业中。然而，在现有的野生变家种博落回资源中，活性成分血根碱的含量仅在0.3
‑
2.0％区间且不稳定，利用传统的育种技术如选育、杂交育种等很难显著提高博落回中的血根碱含量，且面临着育种周期长和成本高的问题。
[0003]对基因进行定点修饰，是生物研究领域重要的方法之一。随着科学的发展，越来越多的沉默技术发展迅速。从经典的MES随机诱变，T
‑
DNA或转座子插入失活到锌指结构(ZFs)与转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)定点突变，这些技术都大大促进了研究基因功能的进程。但由于锌指核糖核酸酶(ZFN)与转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)技术需要针对每一个目的基因设计特定的内切酶，且构建过程繁琐，大大限制了其应用范围。与其他沉默体系相比，CRISPR定点突变技术有其无法比拟的优点，逐渐被广泛地应用与基因定点修饰研究中。
[0004]CRISPR/Cas体系最早是在大肠杆菌中发现的，是细菌针对噬菌体等外源DNA的获得性免疫系统，该系统主要依赖于crRNA与Cas蛋白形成的核糖核蛋白复合物识别靶序列上的PAM结构，进而对入侵噬菌体或质粒进行特异性切割。CRISPR系统主要有三种类型,其中II型体系仅需要一个Cas9蛋白、crRNA与tracrRNA就能行使其功能。有研究表明将crRNA与tracrRNA整合成sgRNA并不影响CRISPR/Cas9体系的作用。2013年8月，自然生物技术期刊上首次同时发表了三篇有关CRISPR/Cas9体系成功应用于植物基因修饰的研究。之后，CRISPR/Cas9体系被广泛地应用于拟南芥、烟草、水稻、高粱等模式植物及作物研究上，药用植物博落回在已构建的CRISPR/Cas9基因编辑体系的基础上，可以考虑进一步应用于实际的育种研究中。
[0005]博落回中的McSMT基因是位于白屈菜红碱分支通路中的一个关键的甲基转移酶基因，该酶主要催化金黄紫堇碱生成四氢非洲防己碱后再通过系列转化生成白屈菜红碱。白屈菜红碱分支为血根碱合成通路的竞争通路，且两条通路效率基本相当，若能将白屈菜红碱合成通路有效截断，只保留血根碱合成通路，将有可能实现以提高血根碱含量为目标的博落回种质创新。

技术实现思路
：
[0006]本专利技术的首要目的是提供一种提高博落回中血根碱含量的方法。该方法构思新颖，操作简单，使得博落回中血根碱含量得到显著提升，具有广阔的实际生产意义。
[0007]本专利技术通过沉默博落回中的McSMT基因表达或者敲除McSMT基因，提高博落回中血
根碱含量，所述的McSMT基因全长序列及CDS区序列如SEQ ID NO.1和2所示。
[0008]所述的提高博落回中血根碱含量的方法，采用CRISPR/Cas9基因编辑体系敲除McSMT基因。
[0009]所述的提高博落回中血根碱含量的方法，具体包括以下步骤：
[0010]1)博落回McSMT基因靶位点引物设计与合成；
[0011]2)博落回基因敲除载体构建；
[0012]3)根癌农杆菌介导的博落回遗传转化。
[0013]所述的提高博落回中血根碱含量的方法，
[0014]步骤1)博落回McSMT基因靶位点引物设计与合成：
[0015]①
、使用植物基因组编辑靶位点设计软件，在博落回McSMT基因的编码区避开内含子区域设计一个McSMT基因靶位点Guide1，靶位点的设计原则有：a、靶位点主要包括20个碱基，并且这20个碱基3
’
端是N为任意碱基的NGG的3个碱基的PAM区；b、靶位点选择在基因编码区的前端；c、Guide1序列的第一个碱基必须是G，当设计的Guide1序列第一个碱基不是G时，将需要在前面加一个G碱基；优选：Guide1序列为GCCGCGGATGTGTGGGTACT；如SEQ ID NO.3所示；
[0016]②
、以
①
中设计的基因靶位点Guide1，结合pRGEB32质粒(购买于淼灵质粒平台)Bsa I酶切位点粘性末端设计靶位点引物对pRGEB32
‑
SMT
‑
Guide 1
‑
Oligo 1和pRGEB32
‑
SMT
‑
Guide 1
‑
Oligo 2，具体序列：
[0017]pRGEB32
‑
SMT
‑
Guide 1
‑
Oligo 1：GGCAGCCGCGGATGTGTGGGTACT；如SEQ ID NO.4所示；pRGEB32
‑
SMT
‑
Guide 1
‑
Oligo 2：AAACAGTACCCACACATCCGCGGC，如SEQ ID NO.5所示。
[0018]所述的提高博落回中血根碱含量的方法，
[0019]步骤2)博落回基因敲除载体构建：
[0020]①
、将pRGEB32质粒用Bsa I酶切成线性化质粒，电泳，回收纯化目标片段；
[0021]②
、将合成的靶位点Oligos序列进行退火磷酸化反应，获得靶点双链；
[0022]③
、将
②
中的靶点双链序列通过连接酶与pRGEB32线性化载体相连接，连接产物转染至DH5α感受态细胞细胞中，震荡培养，抗生素筛选，菌落PCR鉴定筛选阳性克隆，鉴定正确重组载体命名为：pRGEB32
‑
SMT1。
[0023]所述的提高博落回中血根碱含量的方法，
[0024]步骤3)根癌农杆菌介导的博落回遗传转化：
[0025]①
、将已构建好的重组质粒pRGEB32
‑
SMT1转化根癌农杆菌，震荡培养，抗生素筛选，得到根癌农杆菌单菌落；
[0026]②
、挑选根癌农杆菌单克隆提取质粒，PCR鉴定筛选阳性克隆测序，阳性克隆进行扩大培养，菌液进行博落回外植体侵染；
[0027]③
、完成侵染的博落回外植体进行共培养，后进行筛选培养，完成整个组培过程，获得博落回转基因阳性幼苗。
[0028]所述的提高博落回中血根碱含量的方法，
[0029]载体构建鉴定引物
[0030]M13R：GAGCGGATAACAATTTCACACAGG，如SEQ ID NO.6所示；
[0031]pRGEB32
‑
R：GACCCGAATTTGT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高博落回中血根碱含量的方法，其特征在于，通过沉默博落回中的McSMT基因表达或者敲除McSMT基因，提高博落回中血根碱含量，所述的McSMT基因全长序列及CDS区序列如SEQ ID NO.1和2所示。2.根据权利要求1所述的提高博落回中血根碱含量的方法，其特征在于，采用CRISPR/Cas9基因编辑体系敲除McSMT基因。3.根据权利要求2所述的提高博落回中血根碱含量的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：1)博落回McSMT基因靶位点引物设计与合成；2)博落回基因敲除载体构建；3)根癌农杆菌介导的博落回遗传转化。4.根据权利要求3所述的提高博落回中血根碱含量的方法，其特征在于，步骤1)博落回McSMT基因靶位点引物设计与合成：
①
、使用植物基因组编辑靶位点设计软件，在博落回McSMT基因的编码区避开内含子区域设计一个McSMT基因靶位点Guide1，靶位点的设计原则有：a、靶位点主要包括20个碱基，并且这20个碱基3
’
端是N为任意碱基的NGG的3个碱基的PAM区；b、靶位点选择在基因编码区的前端；c、Guide1序列的第一个碱基必须是G，当设计的Guide1序列第一个碱基不是G时，将需要在前面加一个G碱基；优选：Guide1序列为GCCGCGGATGTGTGGGTACT；
②
、以
①
中设计的基因靶位点Guide1，结合pRGEB32质粒Bsa I酶切粘性末端设计靶位点引物对pRGEB32
‑
SMT
‑
Guide 1
‑
Oligo 1和pRGEB32
‑
SMT
‑
Guide 1
‑
Oligo 2，具体序列pRGEB32
‑
SMT
‑
Guide 1
‑
Oligo 1：GGCAGCCGCGGATGTGTGGGTACT；pRGEB32
‑
SMT
‑
Guide 1
‑
Oligo 2：AAACAGTACCCACACATCCGCGGC。5.根据权利要求3所述的提高博落回中血根碱含量的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾建国，孙梦姗，黄鹏，刘薇，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：