栀子八氢番茄红素合酶基因（GjPSY）原核表达及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种栀子八氢番茄红素合酶基因(GjPSY)原核表达载体的构建方法，本发明专利技术还提供了所述栀子八氢番茄红素合酶基因原核表达的最适诱导表达条件。本发明专利技术为后续研究栀子八氢番茄红素合酶基因的功能及栀子黄色素类化合物生物合成调控奠定了基础。类化合物生物合成调控奠定了基础。类化合物生物合成调控奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
栀子八氢番茄红素合酶基因(GjPSY)原核表达及应用


[0001]本专利技术属于分子育种
，本专利技术提供了一种栀子八氢番茄红素合酶GjPSY基因原核表达载体的构建，本专利技术还提供了栀子八氢番茄红素合酶基因的最适原核诱导表达条件。

技术介绍

[0002]栀子作为传统中药，是卫生部颁布的第一批药食两用资源，具有清热利尿，凉血解毒等功效。现代研究发现，栀子中含有环烯醚萜类(栀子苷类)、黄酮类(栀子素类)、三萜类(栀子花酸类)、有机酸酯类(绿原酸、藏红花酸类)、挥发油等成分。其中，栀子果具有较高的营养和药用价值，不仅含有丰富的栀子黄色素、栀子苷、栀子油脂、有机酸、黄酮类化合物，而且还富含铁、硅、锰、硼、铜等微量元素。作为一种常用中药，栀子属植物化学成分以及药理作用有着广泛的研究前景。现代药理研究表明栀子具有抗炎、解热、镇痛、保肝、利胆、降血脂、抗血栓、神经保护、镇静催眠等作用。现今栀子的应用主要分为两方面：在医药方面，栀子果实用于中成药生产、传统中药的抓配、深加工提取其中有效成分(如栀子苷、熊果酸等等)作为药物中间体和实验试剂等；在食品方面，主要用于提取栀子黄色素，或提取有效成分用来合成栀子红色素、栀子蓝色素等。随着对栀子研究的深入，会有越来越多的新药理作用被发现。因此，栀子仍然具有开发价值，值得进一步深入研究。
[0003]栀子黄色素是一类安全性高、着色力强、成本较低、国际上允许生产和使用的天然食用黄色素，无毒副作用，栀子黄色素易溶于水、乙醇等极性溶剂，难溶于苯、汽油等非极性溶剂。栀子黄色素热稳定性强，在80℃以下稳定性良好。栀子黄色素是一种混合物，包括藏红花素、藏红花酸、绿原酸、黄酮、京尼平苷等。研究表明，栀子黄色素具有促进胆汁分泌，增强肝脏解毒功能等作用，同时能够降低血中胆红素及胆固醇含量。栀子作为传统中药材，目前已在天然食用色素(栀子黄色素及栀子蓝色素)的生产中占据重要地位。近年来，天然食用色素在国际市场上销售额的增长率每年都保持在10％以上，正逐渐占领合成色素的市场份额，前景十分看好。
[0004]栀子黄色素的生物合成需要多种途径的高度协调，包括上游甲基赤藓糖醇磷酸(MEP)途径、中游类胡萝卜素生物合成途径，以及下游藏红花素生物合成途径。八氢番茄红素合成酶(phytoene synthase,PSY)是类胡萝卜素合成过程中的第一个限速酶，催化2分子的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)缩合形成八氢番茄红素，八氢番茄红素由八氢番茄红素脱氢酶(PDS)催化形成ζ
‑
胡萝卜素，再由ζ
‑
胡萝卜素脱氢酶(ZDS)连续催化形成番茄红素。虽然目前从各种植物、动物及微生物中分离的到的八氢番茄红素合酶基因很多，但在本专利技术申请之前，国内没有人公开或发表过栀子八氢番茄红素合酶GjPSY原核表达载体(pQE30)的构建方法及其诱导表达条件。

技术实现思路

[0005]1.本专利技术提供了一种栀子八氢番茄红素合酶基因(GjPSY)原核表达载体的构建方
法。其步骤为：
①
根据栀子转录组数据筛选GjPSY基因，并设计特异性引物；
②
以栀子果为材料提取RNA，并反转录成cDNA；
③
克隆GjPSY基因核心cDNA序列，连接pQE30载体后转入大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆测序；
[0006]2.本专利技术提供了一种栀子八氢番茄红素合酶基因GjPSY的最适原核表达条件。其步骤为：
①
将GjPSY
‑
pQE30转入M15；
②
设计IPTG诱导表达体系，并诱导表达；
③
进行电泳；
④
根据电泳结果确定GjPSY的最适原核诱导表达条件。
附图说明
[0007]图1为PCR扩增栀子八氢番茄红素合酶(GjPSY)基因核心cDNA片段的电泳图，其中，M为DL2000 Marker，1号泳道为GjPSY基因核心cDNA片段PCR产物。
[0008]图2为GjPSY基因原核表达蛋白电泳图。
[0009]表1为GjPSY基因原核表达最适表达条件。
具体实施方案
[0010]1、实验材料：本研究分别采取栀子栽培品种
‘
林海一号
’
不同生长时期，即幼果期(开花后20天)、青果期(开花后54天)、黄果期(开花后87天)、红果期(开花后129天)和成熟期(开花后155天)的根、茎、叶和果实，液氮速冻后于
–
80℃保存备用。
[0011]2、使用TIANGEN公司的RNAprep Pure PlantPlus Kit试剂盒，分别提取栀子3个生长时期的根、茎、叶和果实的总RNA，使用TAKARA公司的PrimeScrip II 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒合成cDNA第一链，测定其浓度后于
‑
20℃保存，用于基因克隆和RT
‑
qPCR。
[0012]3、根据栀子
‘
林海一号
’
转录组数据分析获得栀子八氢番茄红素合酶候选基因序列，根据该序列设计引物(P1：5'
‑
AGTTATCTTCGTTCCGCC
‑
3'；P2：5'
‑
GCTCTGCTATGCCCTTCT
‑
3')。
[0013]4、以栀子果总RNA反转录的cDNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增反应的体系如下：
[0014][0015]栀子八氢番茄红素合酶基因GjPSY核心片段PCR扩增反应的反应程序为：95℃ 5min；95℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 2min，30个循环；72℃ 5min。
[0016]5、PCR产物为一条约1400bp的片段，将该片段与pM18
‑
T载体相连送铂尚生物技术(上海)有限公司测序。
[0017]6、设计连接pQE30加入酶切位点引物(P3：CGGGGTACCATGTCTTGCAGAAATATC；P4：
AAGCTTGTCTTACTCTTCACCAACATCCCT)，以GjPSY
‑
pM18
‑
T为模板进行pCR扩增。
[0018]7、胶回收PCR产物(GjPSY(pQE30))，与pM18
‑
T载体连接，转化至大肠杆菌DH5α中；挑单克隆提质粒。
[0019]8、将GjPSY(pQE30)
‑
pM18
‑
T和pQE30用KpnI和HindIII双酶切，酶切产物分别胶回收。
[0020]9、将胶回收产物GjPSY(pQE30)、pQE30连接，转化至大肠杆菌M15中。
[0021]10、挑单克隆摇菌、提质粒后测序，获得转入GjPSY
‑
pQE30的M15菌种。
[0022]11、设计GjPSY
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种栀子八氢番茄红素合酶基因(GjPSY)原核表达载体的构建方法，其核心在于根据栀子转录组数据筛选并克隆了GjPSY基因的核心cDNA序列，并将该片段与pQE30载体连接构建原核表达载体GjPSY
‑
pQE30。2...

【专利技术属性】
技术研发人员：寻佳涵，曾锦，佘宇航，刘芳，陈建荣，
申请(专利权)人：长沙学院，
类型：发明
国别省市：