一种用于单细胞捕获以及离心液滴生成的装置及其应用制造方法及图纸

本发明专利技术涉及到用于单细胞捕获以及离心液滴生成的装置及其应用，该装置设计了双层微孔结构，方便完成单个细胞的捕获，解决了液滴MDA需要繁琐的单细胞分离的缺点。将该结构整合在管盖中，方便试剂的添加以及液体的转移。另外，还设计了一种离心驱动的液滴生成结构，通过单细胞捕获芯片分离出单个细胞并加入裂解液和PBS缓冲液，裂解释放细胞基因组DNA。随后加入终止缓冲液终止分裂，并加入MDA扩增试剂后生成乳化液滴。本发明专利技术方便液滴的生成，解决了传统液滴生成方法成本高，时间长，操作繁琐等缺点。此外，两种装置可以非常好的整合在一起，形成一管式平台，实现单细胞捕获，液滴生成等集成化操作。该平台有望广泛的应用于基础研究以及临床诊断。及临床诊断。

A device for single cell capture and centrifugal droplet generation and its application

【技术实现步骤摘要】
微米，所述第二凹槽截面的内切圆直径为10微米
‑
100微米。
[0012]本专利技术的另一目的，在于提供所述的装置在液滴生成中的应用。
[0013]本专利技术的再一目的，在于提供所述的装置多重置换扩增反应中的应用。
[0014]本专利技术的再一目的，在于提供.一种多重置换扩增反应方法，包括如下步骤：
[0015]1)配置所述的装置；
[0016]2)细胞取用：将细胞悬浮液离心，再用缓冲溶液重悬；
[0017]3)单细胞捕获
[0018]在盖子中滴加含细胞的缓冲液，静置待细胞沉降，落入第二凹槽。若细胞未落入第二凹槽，使用吹打后放至震荡孵育器震荡；若细胞仍未落入凹槽，可继续震荡；在第二凹槽捕获细胞后，用缓冲溶液轻轻吹打芯片，洗去多余的细胞，最终只留下第二凹槽的单细胞；
[0019]4)液滴生成
[0020]进行细胞裂解，之后进行DNA扩增，然后将盖体和芯篇和管体组装成完整的装置后，离心，在管体内生成液滴；
[0021]5)MDA产物文库构建
[0022]纯化后让DNA片段化，最后进行PCR富集。
[0023]优选地，步骤1)中加入1
‑
5％的聚乙二醇水溶液并在烘箱中烘干。
[0024]优选地，步骤3)中，向取用的细胞悬浮液中滴加细胞染剂对细胞进行染色。
[0025]优选地，步骤4)的离心，为500
‑
15000rpm下转1
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5min。
[0026]本专利技术与
技术介绍
相比具有的优点有：
[0027]1、本专利技术的装置解决了现有的多重置换扩增反应中，手动将单个细胞放入缓冲液中操作过于困难的缺点。
[0028]2、本专利技术的液滴生成装置制作简单
[0029]3、本专利技术液滴生成简单、高效，同时，具有稳定性和准确性。
附图说明
[0030]图1为本专利技术的一管式平台结构示意图。
[0031]图2为本专利技术的原理示意图。
[0032]图3为芯片生成装置，(A)芯片模板结构；(B)打孔笔；(C)八连管盖芯片。
[0033]图4为芯片捕获MRC
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5细胞全过程在显微镜下的成像，明场和荧光场一一对应。(A)重悬前；(B)重悬后；(C)洗涤后。
[0034]图5为液滴生成装置及实物(A)防蒸发高温胶布；(B)装置组成；(C)离心生成液滴； (D)液滴实物。
[0035]图6为单细胞捕获效率分析。(A)不同沉淀时间和细胞浓度下的捕获效率；(B)不同细胞捕获效率的比较。
[0036]图7为微液滴表征。(A)不同孔径毛细管生成液滴的比较；(B)不同毛细管孔径和液滴直径。
[0037]图8为归一化读取深度图。
具体实施方式
[0038]实施例1
[0039]参见图1，为本专利技术管式平台的结构示意图。图中，1为管体，2为漏斗部，3为毛细管， 4为油相液体，5为盖体，6为胶，7为第一凹槽，8为第二凹槽。
[0040]其中，管式平台包括八连管，所述的八连管包括管体1和盖体2，管体1的上部设有倒锥形的漏斗部2，漏斗部2的底部向下设有毛细管3，管体1的下半部设有油相液体4，毛细管3底端插入该油相液体中。盖体5的底部设有芯片6，所述的芯片6底部向上设有第一凹槽7，所述的第一凹槽7的上底面向上设有第二凹槽6。
[0041]所述第第一凹槽7的横截面为正方形，所述第二凹槽6的横截面为正六边形。第二凹槽 6的横截面小于第一凹槽7的横截面。
[0042]所述第一凹槽6截面的内切圆直径为5微米～1000微米，所述第二凹槽7截面的内切圆直径为1微米
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500微米。进一步优选，所述第一凹槽6截面的内切圆直径为20微米
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200微米，所述第二凹槽7截面的内切圆直径为10微米
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100微米。
[0043]离心驱动液滴MDA
[0044]具体步骤如下:
[0045]1、芯片制作
[0046]1)配胶：在塑料杯中分别加入30gPDMS单体和3gPDMS引发剂，用勺子搅拌均匀，放入高压灭菌锅之中30min抽真空排气泡。
[0047]2)芯片生成：拿出一个干净的培养皿，在底部倒上适量的PDMS混合胶，将如图3(A) 所示的芯片模板放入培养皿之中(所述的芯片模板上和培养皿形状配套，未显示的另一面设有多个凸柱，凸柱的下半部为截面为正六边形的六柱体，上半部为截面为正四边形的四柱体)，芯片模板具有凸柱的一面朝上，然后倒入3
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5mm厚的PDMS混合胶，待无气泡后放入95℃烘箱加热8min后取出。待冷却后，先用手术刀将凸柱结构所在大范围割下，再用如图3(B) 所示改进过的打孔笔打孔，将凸柱结构所在的区域打下，得到芯片6。
[0048]3)修饰：在芯片6的凹槽面上滴加疏水化试剂EGC
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1720，后置于35℃烘箱中约烘干10min。而后加入2％的聚乙二醇水溶液并在35℃烘箱中烘干。
[0049]4)粘合：将芯片凹槽面朝外用配好的PDMS粘合在八连管的盖子上，生成如图3(C)所示芯片。
[0050]2、细胞取用
[0051]1)将A549细胞从CO2培养箱中取出，吸去表面培养基，加入1mL胰酶并吹打使贴壁细胞悬浮(悬浮细胞可不需要此步骤)。
[0052]2)吸去胰酶消化液，用适量PBS缓冲液吹打、洗涤培养皿，之后将细胞悬浮液吸入1.5mL 离心管中。
[0053]3)在1000rpm下离心3min，结束之后再用PBS缓冲溶液重悬。
[0054]3、单细胞捕获，全程如图4所示：
[0055]1)向取用的细胞悬浮液中滴加1μL的钙黄绿素染剂，混匀，之后孵育10min。
[0056]2)在迷你离心机上用1000rpm离心3min，离心完毕后用移液枪吸掉上清液，之后用PBS 缓冲溶液洗涤沉淀，吹打混匀。重复上述操作三次完成染色剂洗涤。
[0057]3)将15μL质量分数为0.1％的BSA溶液滴加在八连管盖中，之后在65℃的烘箱中加
热 30min，取出。
[0058]4)用20μL移液枪在盖子中滴加15μLPBS缓冲溶液，之后放入真空干燥箱抽真空10min，以抽取凹槽中的气泡。
[0059]5)吸去芯片上PBS缓冲液，在显微镜下对芯片进行操作：吸取1μL细胞滴于芯片中央的标记处，静置1min待细胞沉降，落入凹槽。若细胞未落入凹槽，使用移液枪吹打后放至震荡孵育器震荡1min。若细胞仍未落入凹槽，继续震荡，直至落入凹槽为止，并记录重悬次数。
[0060]6)在捕获细胞后，用PBS缓冲溶液轻轻吹打芯片，洗去多余的细胞，最终只留下小凹槽的单细胞。
[0061]4、液滴生成
[0062]1)准备Buffer D2：从冰箱中取出单细胞WGA试剂盒，在冰盒上于200μL离心管中分别加入4μLDTT(1M)、36μ本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于单细胞捕获以及离心液滴生成的装置，其特征在于，包括管体和盖体，管体的上部设有漏斗部，漏斗部的底部向下设有毛细管，管体的下半部设有油相液体，毛细管底端插入该油相液体中；盖体的底部设有芯片，所述的芯片底部向上设有第一凹槽，所述的第一凹槽的上底面向上设有第二凹槽；第二凹槽的横截面小于第一凹槽的横截面。2.如权利要求1所述的装置，其特征在于，还包括一离心设备。3.如权利要求1或2所述的装置，其特征在于，所述的管体和盖体，为八连管或十二联管的管体和盖体。4.如权利要求1或2所述的装置，其特征在于：所述第一凹槽的横截面为正方形，所述第二凹槽的横截面为正六边形。5.如权利要求1或2所述的装置，其特征在于：所述第一凹槽截面的内切圆直径为5微米
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1000微米，所述第二凹槽截面的内切圆直径为1微米
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500微米。6.如权利要求1至5任一项所述的装置在液滴生成和/或多重置换扩增反应中的应用。7.一种多重置换扩增反应方法，包括如下步骤：1)配置权利要求1
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5任一项所述的装置；2)细胞取用：将...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨朝勇，尹坤，梁点一，朱志，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：