一种肠源性益生菌株及其培养方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种肠源性益生菌株及其培养方法和应用，所述益生菌命名为嗜酸乳杆菌LA18，能够高效合成乳酸菌素，而且具备耐胃酸、胆盐及高温的特性。该菌株的培养方法为：取成年猪小肠段部分，水浴振荡，将水浴液进行选择性培养，特异性筛选具备产酸能力和胆盐耐受能力的乳酸菌属，然后挑取有明显有差异的菌株进行对峙培养，挑取明显具有透明圈的菌株检测抑菌性能，选取抑菌性最好的菌株进行ARTP诱变选育，结合96孔板初筛、摇瓶发酵复筛进一步优选抑菌性能显著提高的菌株，再进行测试，筛选得到同时具备温度、酸碱以及蛋白酶稳定性的优良突变菌株LA18，并对其进行分子鉴定及遗传稳定性的考察，得到嗜酸乳杆菌LA18并进行保藏。得到嗜酸乳杆菌LA18并进行保藏。

An intestinal probiotic strain and its culture method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种肠源性益生菌株及其培养方法和应用


[0001]本专利技术涉及嗜酸乳杆菌的
，具体涉及一种肠源性益生菌株及其培养方法和应用。

技术介绍

[0002]随着禁抗政策的落实，新的绿色、安全、有效、无公害的抗生素替代品的开发与应用成为降低饲料“禁抗”后对养殖业影响的有利措施，也是畜禽养殖发展的必然趋势。研究抗生素及其替代品，大多数是通过研究肠道内微生态变化来探索其对动物机体影响的作用机制。所以，新型抗生素的替代品至少应具备以下几个重要特征：1）调整肠道共生物微生物群落结构；2）保证动物肠道结构完整，促进营养物质吸收；3）维护肠道免疫系统稳态，保持动物健康度。这些作用互相关联，并且它们都与肠道健康直接相关。功能型微生态制剂是新一代替抗产品的典型代表之一，它们种类繁多、活性独特、功能多样，通过调节肠道微生态平衡、竞争性抑制肠道内的病原微生物，从而帮助动物建立有利于宿主的肠道微生态区系，提高机体免疫机能，改善饲料利用效率，促进动物生长，预防疾病。乳酸杆菌属作为动物肠道中的优势菌群，是常见的益生菌，已作为微生态制剂广泛应用于畜牧养殖，不仅可以抑制致病菌在肠道中定植，维持肠道微生物区系平衡，而且可以调控宿主的免疫力，还可以改善肠道形态结构，是动物肠道微生态平衡与肠道健康的关键指标。其中，嗜酸乳杆菌作为具备较好过胃并在肠道内存活能力益生菌，能够有效的定植于动物肠道上皮细胞，并通过产生乳酸、乳酸菌素等抑制肠道内的有害菌，从而保护胃肠道，提高动物的抗病能力。但是由于不同来源的嗜酸乳杆菌的定植能力、代谢产物功能以及抗逆性差异大，大大影响了其在生产实践中的应用，也限制了其该类菌株益生功能的发挥。

技术实现思路

[0003]为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的之一在于提供一种肠源性益生菌株，能够高效合成乳酸菌素，而且具备耐胃酸、胆盐及高温的特性；本专利技术的目的之二在于提供一种肠源性益生菌株的应用，有助于维护动物肠道微生物群落平衡，提高生产性能，作为功能微生物态制剂产品在减抗、替抗等方面具备良好的应用前景。本专利技术的目的之三在于提供一种肠源性益生菌株的培养方法。
[0004]本专利技术的目的之一采用如下技术方案实现：一种肠源性益生菌株，所述益生菌株命名为嗜酸乳杆菌LA18(Lactobacillus acidophilus LA18)，保藏号为GDMCC No: 62222，保藏日期为2022年1月13日，保藏分类命名为嗜酸乳杆菌，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心，保藏单位地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
[0005]进一步，所述嗜酸乳杆菌LA18的rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
[0006]本专利技术的目的之二采用如下技术方案实现：上述的肠源性益生菌株的应用，所述肠源性益生菌株用于制备抑制致病菌的微生
物态制剂。
[0007]本专利技术的目的之三采用如下技术方案实现：上述的肠源性益生菌株的培养方法，包括以下步骤：1）取健康成年猪小肠段部分，取部分内容物装入含有无菌生理盐水的三角瓶中，水浴振荡后，将水浴后的液体采用梯度稀释的方式涂布于含有猪胆盐和碳酸钙的选择性培养基的表面，进行培养；2）在含有步骤1）的选择培养基的平板上挑取菌落呈乳黄色至乳白色、表面有凸起、湿润无褶皱、有明显溶钙圈的特异菌种，选取革兰氏染色为阳性的杆菌，并重复划线于MRS固体培养基，培养，得到纯化菌株，再将纯化菌株点殖于含有金黄色葡萄球菌作为检菌的平板中进行对峙培养，挑取明显具有透明圈的菌株进行摇瓶发酵复筛，并采用琼脂扩散法检测摇瓶发酵上清液的抑菌性能，选取抑菌圈直径最大的菌株；3）将步骤2）选取的菌株进行ARTP诱变选育，结合96孔板初筛、摇瓶发酵复筛选取抑菌性能更佳的菌株，再进行热稳定性测试、酸碱度稳定性测试和蛋白酶稳定性测试，筛选得到同时具备温度、酸碱以及蛋白酶稳定性的优良突变菌株LA18，并对优良突变菌株LA18进行分子鉴定及遗传稳定性的考察，最终获得肠源性益生菌株嗜酸乳杆菌LA18并进行保藏。
[0008]进一步，步骤1）中，所述健康成年猪小肠段指的十二指肠、空肠、回肠各部分，分别选择长5~6cm的部分，剪断后两端分别用灭菌棉绳扎紧，并立即存放于冰盒中，0.5~1小时内进行菌种分离工作，具体操作为：在无菌环境中将各肠段内容物挤出，称取5~6g的肠道内容物，加入含有50mL无菌生理盐水中；在70~80℃下水浴5~10min，采用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释；所述选择性培养基为在MRS培养基的基础上，额外加入猪胆盐和碳酸钙的培养基。
[0009]其中，MRS培养基的具体包括: K2HPO
4 2.0 g，无水乙酸钠 5.0 g，酵母粉 5.0 g，MgSO
4 0.5 g，牛肉膏 10.0g，柠檬酸铵 2.0 g，胰蛋白胨 10.0g，葡萄糖20.0 g，硫酸镁0.2 g，硫酸锰0.05g，吐温80 10.0 g，蒸馏水 1000 mL，额外每100mL培养基同时加入0.5g的猪胆盐和3.0g的碳酸钙，pH值6.4
±
0.2，将上述成分混合后在121 ℃灭菌 15 min制备得到选择性培养基。
[0010]再进一步，步骤2）中，所述对峙培养的方法包括以下步骤：将纯化菌株点殖于含有金黄色葡萄球菌的肉汤培养基固体平板，37~38℃培养18~24h，其中，金黄色葡萄球菌作为指示菌，按照每100mL培养基加入10μL指示菌（108CFU/mL）的比例制备对峙平板；具体地，肉汤培养基组成包括：牛肉膏５.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，蒸馏水1000mL，pH值6.8
±
0.2，将上述组分混合后在121 ℃灭菌 20 min得到，pH值为6.8
±
0.2；所述明显具有透明圈的菌株为在对峙平板中，在含有指示菌的平板中形成明显的抑菌圈的菌株，具体地，抑菌能力的大小跟菌株差异以及菌落直径的大小有关，抑菌能力一般按照抑菌圈直径与菌落直径的比值做抑菌能力的初步排序，比值越大，抑菌性能越强。进一步，步骤2）中，所述摇瓶发酵复筛的步骤为：挑取所述抑菌圈直径与菌落直径的比值大于4的菌株转接含有摇瓶发酵培养基的摇瓶内，250mL的摇瓶装液量为50 mL，在150~200rpm的转速和温度为37~38℃下发酵36~48h；发酵结束后，选用浓度为20~30%氢氧化钠溶液调节pH至5.5~6.0g，排除有机酸对后续测定的干扰，8000r/min离心收集发酵上清
液，测定上清液对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌的抑菌活性；其中，摇瓶发酵培养基组成包括：黄豆饼粉 45.0g，玉米淀粉 15.0g，蔗糖25.0g，葡萄糖5.0g，酵母膏20.0g，乙酸钠 5.0g，柠檬酸二铵 2.0g，硫酸胺 1.0g，轻质碳酸钙 6.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，吐温80 10.0g，甘蔗糖蜜 15.0g，蒸馏水1000mL，pH至6.0
‑
6.5，将上述组分混合后在121 ℃灭菌 20 min得到。
[0011]再进一步，步骤3）中，所述ARTP本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肠源性益生菌株，其特征在于，所述益生菌株命名为嗜酸乳杆菌LA18，保藏号为GDMCC No: 62222，保藏日期为2022年1月13日，保藏分类命名为嗜酸乳杆菌，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心，保藏单位地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。2.如权利要求1所述的肠源性益生菌株，其特征在于，所述嗜酸乳杆菌LA18的rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。3.权利要求1或2所述的肠源性益生菌株的应用，其特征在于，所述肠源性益生菌株用于制备抑制致病菌的微生物态制剂。4.权利要求1或2所述的肠源性益生菌株的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：1）取健康成年猪小肠段部分，取部分内容物装入含有无菌生理盐水的三角瓶中，水浴振荡后，将水浴后的液体采用梯度稀释的方式涂布于含有猪胆盐和碳酸钙的选择性培养基的表面，进行培养；2）在含有步骤1）的选择培养基的平板上挑取菌落呈乳黄色至乳白色、表面有凸起、湿润无褶皱、有明显溶钙圈的特异菌种，选取革兰氏染色为阳性的杆菌，并重复划线于MRS固体培养基，培养，得到纯化菌株，再将纯化菌株点殖于含有金黄色葡萄球菌作为检菌的平板中进行对峙培养，挑取明显具有透明圈的菌株进行摇瓶发酵复筛，并采用琼脂扩散法检测摇瓶发酵上清液的抑菌性能，选取抑菌圈直径最大的菌株；3）将步骤2）选取的菌株进行ARTP诱变选育，结合96孔板初筛、摇瓶发酵复筛选取抑菌性能更佳的菌株，再进行热稳定性测试、酸碱度稳定性测试和蛋白酶稳定性测试，筛选得到同时具备温度、酸碱以及蛋白酶稳定性的优良突变菌株LA18，并对优良突变菌株LA18进行分子鉴定及遗传稳定性的考察，最终获得肠源性益生菌株嗜酸乳杆菌LA18并进行保藏。5.如权利要求4所述的肠源性益生菌株的培养方法，其特征在于，步骤1）中，所述健康成年猪小肠段指的十二指肠、空肠、回肠各部分，分别选择长5~6cm的部分，剪断后两端分别用灭菌棉绳扎紧，并立即存放于冰盒中，0.5~1小时内进行菌种分离工作，具体操作为：在无菌环境中将各肠段内容物挤出，称取5~6g的肠道内容物，加入含有50mL无菌生理盐水中；在70~80℃下水浴5~10min，采用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释；所述选择性培养基为在MRS培养基的基础上，额外加入猪胆盐和碳酸钙的培养基。6.如权利要求4所述的肠源性益生菌株的培养方法，其特征在于，步骤2）中，所述对峙培养的方法包括以下步骤：将纯化菌株点殖于含有金黄色葡萄球菌的肉汤培养基固体平板，37~38℃培养18~24h，其中，金黄色葡萄球菌作为指示菌，按照每100mL培养基加入10μL指示菌（108CFU/mL）的比例制备对峙平板；其中，肉汤培养基包括牛肉膏、蛋白胨、氯化钠和水，pH值为6.8
±
0.2；所述明显具有透明圈的菌株为在对峙平板中，在含有指示菌的平板中形成明显的抑菌圈的菌株。7.如权利要求6所述的肠源性益生菌株的培养方法，其特征在于，步骤2）中，所述摇瓶发酵复筛的步骤为：挑取所述抑菌圈直径与菌落直径的比值大于某限定数值的菌株转接含有摇瓶发酵培养基的摇瓶内，在150~200rpm的转速和温度为37~38℃下发酵36~48h；发酵结束后，调节pH至5.5~6.0g，离心收集发酵上清液，测定上清液对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌的抑菌活性；其中，摇瓶发酵培养基包括...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄炜乾，沈水宝，黄钦耿，方文棋，林万华，廖莹，林波，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：