一种三磷酸核苷酸盐的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种三磷酸核苷酸盐的制备方法。本发明专利技术提供的一种三磷酸核苷酸三乙胺盐的制备方法，其包括如下步骤：采用色谱法将活性成分为如式C所示的三磷酸核苷酸的待纯化物进行分离制备，得到如式D所示的三磷酸核苷酸三乙胺盐。该制备方法实现了多种修饰及非修饰三磷酸核苷酸的大规模自动化制备，通用性好，分离度高。分离度高。分离度高。

A preparation method of triphosphate nucleotide salt

【技术实现步骤摘要】
一种三磷酸核苷酸盐的制备方法


[0001]本专利技术涉及一种三磷酸核苷酸盐的制备方法。

技术介绍

[0002]随着核酸药物的发展，mRNA被视为了一种可以用于药物制造的新选择。1990年，一段mRNA被注射进入小鼠体内，并成功编码出了蛋白质。这段mRNA则是通过一种名为体外转录的技术得到的。随后，一项1992年的研究发现注射抗利尿激素编码mRNA可以成功诱导大鼠的下丘脑的神经活动。虽然mRNA显示出很好的生物活性，但是受限于其自身的不稳定性，强免疫原性和体内递送困难，mRNA远远无法应用于临床疾病治疗中。
[0003]修饰核苷酸的加入，可以降低mRNA的自身免疫原性，提高mRNA自身稳定性，进一步增强mRNA在目标细胞内的表达时间和表达效率，使mRMA可以真正用于制药领域。其中Moderna和BioNTech分别采用1
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甲基假尿苷(CN110511939A，CN104114572A,CN103974724A)和假尿苷(US10232055B2，US9597380B2，US9163213B2)，极大的降低了mRNA的免疫原性，并且提高了mRNA在靶细胞内表达目的蛋白的时间和总量，为mRNA制成COVID
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19疫苗并成功上市奠定了基础。
[0004]但是mRNA合成用修饰三磷酸核苷酸制备工艺复杂，尤其是其纯化十分困难且产品稳定性差，导致修饰核苷酸商品售价高达数十万甚至上百元万元每克。现阶段高纯度的修饰三磷酸核苷酸主要采用有机合成方法进行制备，并采用大型制备液相色谱进行分离提纯，设备价格昂贵且需要消耗大量高纯度有机溶剂，纯化效率差且会产生有毒的有机废液，这也被认为是修饰核苷酸价格居高不下的主要原因。因而，研究三磷酸核苷酸的纯化方法迫在眉睫。

技术实现思路

[0005]为了解决现有技术中三磷酸核苷酸化合物纯化方法昂贵，底物适用性不高等问题，本专利技术提供了一种三磷酸核苷酸盐的制备方法。该方法通过使用阴离子交换柱及三乙胺碳酸盐缓冲液的方法成功实现了多种修饰及非修饰三磷酸核苷酸的大规模自动化制备，无需大量使用有机溶剂和昂贵的制备液相色谱，极大的降低了三磷酸核苷酸的制备成本，并且制备纯度高达99％以上，通用性好，分离度高。
[0006]本专利技术提供了一种三磷酸核苷酸三乙胺盐的制备方法，其包括如下步骤：采用色谱法将活性成分为如式C所示的三磷酸核苷酸的待纯化物进行分离制备，得到如式D所示的三磷酸核苷酸三乙胺盐；
[0007][0008]其中，R为碱基，R
’
为
‑
OH、
‑
OCH3或H；
[0009]色谱柱为阴离子交换柱，所述阴离子交换柱填料的配基为季铵基团或二乙胺乙基(DEAE)，流动相包括三乙胺
‑
碳酸缓冲溶液(TEAB)。
[0010]所述分离制备方案包括如下方案一或方案二，
[0011]方案一：所述阴离子交换柱填料的配基为季铵基团；以水为Buffer A，以三乙胺
‑
碳酸缓冲溶液为Buffer B进行分离制备；
[0012]方案二：所述阴离子交换柱填料的配基为二乙胺乙基；以10mM三乙胺
‑
碳酸缓冲溶液为Buffer A，以1M三乙胺
‑
碳酸缓冲溶液为Buffer B进行分离制备。
[0013]所述碱基可为天然碱基或修饰碱基，例如下述结构中的一种：
[0014][0015]所述阴离子交换柱填料的基质可采用本领域公知的基质，优选为交联葡聚糖、具有葡聚糖表面延伸剂的高度交联琼脂糖、聚丙烯酸酯(PMMA)、琼脂糖凝胶、单分散聚苯乙烯
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二乙烯基苯(PS/DVB)、单分散聚苯乙烯或聚甲基丙烯酸酯。
[0016]方案一中，所述阴离子交换柱的填料可为UniQ、NanoQ或Generik MC
‑
Q。
[0017]方案二中，所述阴离子交换柱的填料可为DEAE
‑
Sephadex A250、Capto DEAE、UniDEAE、UniCore
‑
DEAE、DEAE Sepharose 6FF或Generik MC
‑
DEAE，例如DEAE
‑
Sephadex A250、Capto DEAE、UniGel
‑
DEAE或DEAE Sepharose 6FF。
[0018]所述阴离子交换柱的直径可为本领域常规直径，例如5
‑
100mm，又例如7.7
‑
10mm。
[0019]所述阴离子交换柱的柱高可为本领域常规柱长，优选为50
‑
400mm，例如100
‑
300mm，又例如200
‑
220mm。
[0020]方案一中，所述阴离子交换柱填料的粒径为10
‑
30μm，例如15μm。
[0021]方案二中，所述阴离子交换柱填料的粒径为40
‑
120μm，例如50
‑
90μm。
[0022]所述阴离子交换柱的柱温可为4
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20℃，例如4℃。
[0023]所述流动相的起始浓度小于将三磷酸核苷酸三乙胺盐洗脱时的浓度。
[0024]方案一中，所述Buffer A为超纯水。
[0025]方案一中，所述Buffer B为1
‑
2M的三乙胺
‑
碳酸缓冲溶液。
[0026]方案一中，所述分离制备包括如下步骤：(1)3
‑
5倍柱体积的A Buffer平衡；(2)1
‑
3倍柱体积A Buffer洗杂，例如2
‑
2.5倍柱体积；(3)5
‑
20倍柱体积洗脱，B Buffer的最终比例为18％
‑
80％；例如5.5
‑
8倍柱体积洗脱，B Buffer的最终比例为18％
‑
30％；又例如6.5倍柱体积洗脱，B Buffer的最终比例为20
‑
30％；(4)1
‑
2倍柱体积洗脱剩余杂质，B Buffer比例为50％
‑
100％。
[0027]方案二中，所述分离制备包括如下步骤：(1)3
‑
5倍柱体积的A Buffer平衡；(2)0.5
‑
2倍柱体积A Buffer洗杂；(3)8～20倍柱体积洗脱，B Buffer的最终比例为12％～100％；(4)1～2倍柱体积洗脱剩余杂质，B Buffer的比例为60％～100％。
[0028]所述洗脱可包括线性梯度洗脱和/或阶梯梯度洗脱，例如以线性梯度的方式逐渐提高B Buffer比例，收集色谱峰对应样品溶液。
[0029]方案一中，当洗脱采用线性梯度洗脱和阶梯梯度洗脱结合时，其可包括以下本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种三磷酸核苷酸三乙胺盐的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：采用色谱法将活性成分为如式C所示的三磷酸核苷酸的待纯化物进行分离制备，得到如式D所示的三磷酸核苷酸三乙胺盐；其中，R为碱基，R
’
为
‑
OH、
‑
OCH3或H；色谱柱为阴离子交换柱，所述阴离子交换柱填料的配基为季铵基团或二乙胺乙基，流动相包括三乙胺
‑
碳酸缓冲溶液。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法满足下述条件中的一种或多种：(a)所述分离制备包括如下方案一或方案二；方案一：所述阴离子交换柱填料的配基为季铵基团；以水为Buffer A，以三乙胺
‑
碳酸缓冲溶液为Buffer B进行分离制备；方案二：所述阴离子交换柱填料的配基为二乙胺乙基；以10mM三乙胺
‑
碳酸缓冲溶液为Buffer A，以1M三乙胺
‑
碳酸缓冲溶液为Buffer B进行分离制备；(b)所述碱基为天然碱基或修饰碱基；(c)所述阴离子交换柱填料的基质为交联葡聚糖、具有葡聚糖表面延伸剂的高度交联琼脂糖、聚丙烯酸酯、琼脂糖凝胶、单分散聚苯乙烯
‑
二乙烯基苯、单分散聚苯乙烯或聚甲基丙烯酸酯；(d)所述阴离子交换柱的直径为5
‑
100mm；(e)所述阴离子交换柱的柱高为50
‑
400mm；(f)所述阴离子交换柱的柱温为4
‑
20℃；(g)所述流动相的起始浓度小于将三磷酸核苷酸三乙胺盐洗脱时的浓度。3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法满足下述条件中的一种或多种：(a)方案一中，所述阴离子交换柱的填料为UniQ、NanoQ或Generik MC
‑
Q；(b)方案二中，所述阴离子交换柱填料为DEAE
‑
Sephadex A250、Capto DEAE、UniDEAE、UniCore
‑
DEAE、DEAE Sepharose 6FF或Generik MC
‑
DEAE；(c)所述阴离子交换柱的直径为7.7
‑
10mm；(d)所述阴离子交换柱的柱高为100
‑
300mm；(e)方案一中，所述阴离子交换柱填料的粒径为10
‑
30μm；(f)方案二中，所述阴离子交换柱填料的粒径为40
‑
120μm；(g)所述阴离子交换柱的柱温为4℃；(h)方案一中，所述Buffer A为超纯水；
(i)方案一中，所述Buffer B为1
‑
2M的三乙胺
‑
碳酸缓冲溶液；(j)方案一中，所述分离制备包括如下步骤：(1)3
‑
5倍柱体积的A Buffer平衡；(2)1
‑
3倍柱体积A Buffer洗杂；(3)5
‑
20倍柱体积洗脱，B Buffer的最终比例为18％
‑
80％；(4)1
‑
2倍柱体积洗脱剩余杂质，B Buffer比例为50％
‑
100％；(k)方案二中，所述分离制备包括如下步骤：(1)3
‑
5倍柱体积的A Buffer平衡；(2)0.5
‑
2倍柱体积A Buffer洗杂；(3)8～20倍柱体积洗脱，B Buffer的最终比例为12％～100％；(4)1～2倍柱体积洗脱剩余杂质，B Buffer的比例为60％～100％；(l)所述碱基为下述结构中的一种：4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法满足下述条件中的一种或多种：(a)方案二中，所述阴离子交换柱填料为DEAE
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Sephadex A250、Capto DEAE、UniGel
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DEAE或DEAE Sepharose 6FF；(b)所述阴离子交换柱的柱高为200
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220mm；(c)方案一中，所述阴离子交换柱填料的粒径为15μm；(d)方案二中，所述阴离子交换柱填料的粒径为50
‑
90μm；(e)方案一中，所述分离制备包括如下步骤：(1)3
‑
5倍柱体积的A Buffer平衡；(2)2
‑
2.5倍柱体积A Buffer洗杂；(3)5.5
‑
8倍柱体积洗脱，B Buffer的最终比例为18％
‑
30％；(4)1
‑
2倍柱体积洗脱剩余杂质，B Buffer比例为50％
‑
100％。5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，方案一中，所述分离制备包括如下步骤：(1)3
‑
5倍柱体积的A Buffer平衡；(2)2
‑
2.5倍柱体积A Buffer洗杂；(3)6.5倍柱体积洗脱，B Buffer的最终比例为20％
‑
30％；(4)1
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2倍柱体积洗脱剩余杂质，B Buffer比例为50％
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100％。6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述洗脱包括线性梯度洗脱和/或阶梯梯度洗脱。7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述分离制备采用下述方法中的任意一
种：方法101：以NanoQ为填料进行分离制备，以超纯水为Buffer A，以1M的三乙胺
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碳酸缓冲溶液为Buffer B，所述分离制备包括下述步骤，(1)5倍柱体积的A Buffer平衡；(2)2倍柱体积A Buffer洗杂；(3)20倍柱体积线性梯度洗脱，B Buffer的最终比例为80％；(4)1倍柱体积洗脱剩余杂质，B Buffer比例为100％；方法102：以UniQ为填料进行分离制备，以超纯水为Buffer A，以1M的三乙胺
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碳酸缓冲溶液为Buffer B，所述分离制备包括下述步骤，(1)5倍柱体积的A Buffer平衡；(2)2倍柱体积A Buffer洗杂；(3)20倍柱体积线性梯度洗脱，B Buffer的最终比例为80％；(4)1倍柱体积洗脱剩余杂质，B Buffer比例为100％；方法103：以Generik MC
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Q为填料进行分离制备，以超纯水为Buffer A，以1M的三乙胺
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碳酸缓冲溶液为Buffer B，所述分离制备包括下述步骤，(1)5倍柱体积的A Buffer平衡；(2)2倍柱体积A Buffer洗杂；(3)20倍柱体积线性梯度洗脱，B Buffer的最终比例为80％；(4)1倍柱体积洗脱剩余杂质，B Buffer比例为100％；方法104：以Generik MC
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Q为填料进行分离制备，以超纯水为Buffer A，以2M的三乙...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡晓茹，郭传鑫，彭祥然，李松，钱其军，
申请(专利权)人：浙江吉量科技有限公司，
类型：发明
国别省市：