用于生产来自日本曲霉的果糖基转移酶的核酸、载体、宿主细胞和方法技术

本发明专利技术提供了用于生产来自日本曲霉的果糖基转移酶的核酸、载体、宿主细胞和方法。本发明专利技术代表了基因工程领域的进步，并且提供了获得由日本曲霉的ft基因编码的作为分泌蛋白的新重组果糖基转移酶的高产率的方法。重组果糖基转移酶的高产率的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于生产来自日本曲霉的果糖基转移酶的核酸、载体、宿主细胞和方法


[0001]本专利技术涉及基因工程的领域。更具体地，本专利技术涉及获得作为分泌蛋白的新重组果糖基转移酶的改良生产，该重组果糖基转移酶由日本曲霉的ft基因编码。

技术介绍

[0002]也称为低聚果糖(FOS)的果糖低聚物构成一系列同源低聚糖。低聚果糖通常由式GF
n
表示，并且主要由1
‑
蔗果三糖(GF2)、蔗果四糖(GF3)和蔗果五糖(β
‑
fructofuranosylnystose)(GF4)组成，其中两个、三个和四个果糖基单元结合在葡萄糖的β
‑
2,1位置。
[0003]低聚果糖(FOS)的特征在于许多有益特性，比如低甜味强度和可作为益生元。由于低聚果糖的低甜味强度(约为蔗糖的三分之一至三分之二)和低热值(约为0至3kcal/g)，低聚果糖可作为糖替代品用于各种食品中。此外，作为益生元，已有报道低聚果糖用作针对结肠癌的保护剂，增强免疫系统的各种参数，改善矿物质吸收，对血脂和胆固醇浓度的有益影响，并且展示出对于控制肥胖和糖尿病的血糖控制(Dominguez，Ana Luisa等人，“An overview of the recent developments on fructooligosaccharide production and applications.”Food and bioprocess technology 7.2(2014):324
‑
337)。
[0004]然而，低聚果糖仅在水果、蔬菜和蜂蜜中作为天然成分微量存在。由于这种低浓度，从食品中提取低聚果糖在实践中是不可能的。
[0005]已尝试通过具有转糖基化活性的微生物酶由蔗糖酶促合成低聚果糖。然而，之前尝试中的主要限制因素是较低的催化效率，葡萄糖对酶的反馈抑制导致FOS产量较低，而且通过在重组宿主系统中表达的酶来转化蔗糖需要更长的时间。此外，由于与酶的大规模表达、酶的稳定性、发酵和纯化过程相关的另外限制，具有转果糖基化活性的微生物酶的工业生产具有挑战性。
[0006]低聚果糖的商业规模生产需要鉴定和大规模生产高效的酶。由于上述限制，生产具有高效转糖基化活性的微生物酶是一项成本高昂的工作，而这又增加了低聚果糖的生产成本。
[0007]因此，长期以来都需要鉴定和提供高效、廉价并且可工业大规模生产具有优良转糖基化活性的微生物酶的方法，该方法又能够降低低聚果糖的生产成本。

技术实现思路

[0008]技术问题
[0009]本专利技术要解决的技术问题是鉴定和提高生产来自日本曲霉(Aspergillus japonicus)的新果糖基转移酶(UniProtKB:F1ADK9_ASPJA)的产量。
[0010]问题的解决方案
[0011]通过对核酸序列、蛋白质序列、启动子、重组载体、宿主细胞和分泌信号肽进行工
程化改造实现日本曲霉的新果糖基转移酶的过表达解决了这一问题，从而实现新重组果糖基转移酶的高产量。
[0012]另外，对发酵策略进行了修改，以获得约2至5gm/L重组果糖基转移酶的高产量。
[0013]专利技术概述
[0014]本专利技术涉及用于重组表达新果糖基转移酶的核酸、蛋白质序列、载体和宿主细胞。本专利技术还涉及含有融合至新果糖基转移酶的信号肽的前体肽，其能够产生更高产率的作为分泌蛋白的高效酶。
[0015]本专利技术还涉及用于表达作为分泌蛋白的新重组果糖基转移酶的方法。该果糖基转移酶的浓度约为2至5gm/L。过滤后，酶的纯度接近85％，无需成本高昂的色谱程序。
附图说明
[0016]从结合附图的下述描述，本公开的特征将变得更显而易见。应理解，附图仅描述了根据本公开的几种实施方式，并且不应被视为对其范围的限制，以下将通过利用附图来进一步描述本专利技术。
[0017]图1描绘了编码果糖基转移酶的天然ft基因和修饰的ft基因的序列比对。
[0018]图2表示pPICZαA载体的构建方案。
[0019]图3描绘了对重组质粒pPICZαA
‑
ft进行限制性酶切分析的结果。
[0020]图4描绘了由重组毕赤酵母宿主细胞诱导果糖基转移酶的表达。
[0021]图5(a)描绘了在表达重组果糖基转移酶的毕赤酵母KM71H菌株发酵过程中的不同时间点间隔采集的样品的SDS
‑
PAGE分析。图5(b)描绘了纯化后的重组果糖基转移酶的SDS
‑
PAGE分析。
[0022]图6描绘了用于估计果糖基转移酶的活性的葡萄糖标准曲线。
[0023]图7描绘了由蔗糖和重组果糖基转移酶生成低聚果糖(FOS)的过程。
[0024]图8描绘了FOS样品的HPLC分析色谱图。
[0025]序列和序列表的简要描述
[0026]SEQ ID NO:1
‑
新果糖基转移酶的氨基酸序列(654个氨基酸)
[0027]SEQ ID NO:2
‑
编码新果糖基转移酶的修饰的核酸序列(1965个碱基对)
[0028]表1：使用的修饰的信号肽
[0029][0030]在所有分泌信号肽序列中，为了前体蛋白的有效Kex2处理而添加了一段四个氨基酸片段(LEKR)。
[0031]表2：融合至信号肽的果糖基转移酶(ft)基因的修饰的核酸序列
[0032][0033]SEQ ID NO:23
‑
编码分泌型果糖基转移酶的ft基因(1965个碱基对)的天然核酸序列。
[0034]表3：果糖基转移酶(ft)基因的生物活性片段是保守的并且使得其具有催化活性
[0035]位置片段SEO ID NO57
‑
62QIGDPCSEQ ID NO:24119
‑
132DGAVIPVGVNNTPTSEQ ID NO:25320
‑
330SGLPIVPQVSSEQ ID NO:26401
‑
416GDQYEQADGFPTAQQGSEQ ID NO:27
[0036]定义
[0037]除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本方法所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管在载体、宿主细胞、方法和组合物的实践或测试中也可使用与本文中描述的那些类似或等效的任何载体、宿主细胞、方法和组合物，但是现在描述代表性示例。
[0038]应理解，在提供数值范围的情况下，该范围的上限和下限以及在该叙述的范围内的任何其他叙述值或中间值之间的每个中间值均囊括在该方法和组合物中。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围内，并且也囊括在方法和组成的范围内，以该范围内任何具体排除的限制为准。在叙述的范围包括一个或两个界限的情况，则不包括其中一个或两个界限的范围也包括在方法和组合中。
[00本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种修饰的多肽，其中所述多肽是日本曲霉的果糖基转移酶，包括融合至信号肽的SEQ ID NO:1的氨基酸序列，所述信号肽选自包括FAKS、AKS、AK、AT、AA、GA、IN、IV、KP、LZ、SA和其变体的组中。2.根据权利要求1所述的修饰的多肽，其中：a、FAK包括SEQ ID NO:3或其变体的氨基酸序列；b、FAKS包括SEQ ID NO:4或其变体的氨基酸序列；c、AT包括SEQ ID NO:5或其变体的氨基酸序列；d、AA包括SEQ ID NO:6或其变体的氨基酸序列；e、GA包括SEQ ID NO:7或其变体的氨基酸序列；f、IN包括SEQ ID NO:8或其变体的氨基酸序列；g、IV包括SEQ ID NO:9或其变体的氨基酸序列；h、KP包括SEQ ID NO:10或其变体的氨基酸序列；i、LZ包括SEQ ID NO:11或其变体的氨基酸序列；和j、SA包括SEQ ID NO:12或其变体的氨基酸序列；并且其中所述信号肽使包括SEQ ID NO:l的氨基酸序列的多肽能够进行细胞外分泌。3.一种包括SEQ ID NO:2的核苷酸序列的核酸。4.一种编码根据权利要求1所述的肽的核酸。5.根据权利要求4所述的核酸，其中所述核酸选自包括下述的组中：SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和其变体。6.一种表达载体，包括可操作地连接至启动子的根据权利要求3或权利要求4所述的核酸。7.根据权利要求6所述的表达载体，其中用于果糖基转移酶基因的所述启动子选自包括AOX1、ADH3、DAS、FLD1、LRA3、THI11、GAP、YPT1、TEF1、GCw14和PGK1的组中。8.根据权利要求6所述的表达载体，其中载体选自包括pPICZαA、pPICZαB、pPICZαC、pGAPZαA、pGAPZαB、pGAPZαC、pPIC3、pPIC3.5、pPIC3.5K、PAO815、pP...

【专利技术属性】
技术研发人员：拉维，
申请(专利权)人：启示录生物技术私人有限公司，
类型：发明
国别省市：