用于表达重组治疗性肽的N-末端延伸序列制造技术

本发明专利技术涉及用于增强重组治疗性肽的表达的N

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于表达重组治疗性肽的N
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末端延伸序列


[0001]本专利技术涉及用于高水平表达重组治疗性肽的N
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末端延伸序列。本专利技术还涉及使用所述N
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末端延伸序列高水平表达重组治疗性肽的方法。

技术介绍

[0002]自20世纪20年代胰岛素疗法问世以来，肽疗法在医学实践中发挥了显著作用。目前，市场上有60多种经批准的肽类药物，并且预计数量将显著增长。
[0003]胰高血糖素样肽
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1(GLP
‑
1)是一种长度为31个氨基酸的肽激素，其来源于胰高血糖素原样肽的组织特异性翻译后处理。它由肠道内分泌的L细胞和脑干孤束核内的某些神经元在进食时产生和分泌。利拉鲁肽(Liraglutide)是人肠促胰岛素(代谢激素)的衍生物，胰高血糖素样肽
‑
1(GLP
‑
1)用作长效胰高血糖素样肽
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1受体激动剂，与刺激胰岛素分泌的内源性代谢激素GLP
‑
1结合同一受体。
[0004]特立帕肽(Teriparatide)是甲状旁腺激素的重组蛋白形式，由其甲状旁腺激素的初始(N
‑
末端)34个氨基酸组成，是甲状旁腺激素的生物活性部分。它是一种用于治疗某些形式的骨质疏松症有效合成代谢(促进骨形成)剂。
[0005]一种表达质粒被设计成含有作为增强子和启动子区域的调控序列，并导致表达载体上携带的基因的有效转录。精心设计表达载体的目标是高效生产蛋白质，并且这可通过合成大量稳定的信使RNA来实现。
[0006]可以设计对表达施加严格控制的表达载体，并且只有在必要时通过使用合适的表达条件才能大量产生蛋白质。在缺乏对基因表达的严格控制的情况下，该蛋白质也可以组成型表达。
[0007]美国专利第4,916,212号公开了编码生物合成胰岛素前体的DNA序列以及在酵母细胞中制备胰岛素前体和人胰岛素的方法。
[0008]美国专利第7,572,884号公开了一种在酿酒酵母中制备利拉鲁肽的前体，重组利拉肽(Lirapeptide)的方法。
[0009]IN 201741024763A公开了一种通过表达编码利拉肽的合成寡核苷酸制备利拉鲁肽的方法，该合成寡核苷酸可操作地连接至酵母细胞中信号肽的寡核苷酸序列。
[0010]WO 1998/008871A1公开了利用重组DNA技术制备的GLP
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1衍生物及其类似物。
[0011]WO 1998/008872A1公开了利用重组DNA技术制备的GLP
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2衍生物。
[0012]WO 1999/043708A1公开了利用重组DNA技术制备的肠促胰岛素类似物(exendin)和GLP
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1(7
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C)的衍生物。
[0013]WO 2017/021819A1公开了一种通过在原核细胞中表达编码所需蛋白质或肽的合成寡核苷酸作为泛素融合构建体来制备肽或蛋白质或其衍生物的方法。
[0014]Avicenna J Med Biotech 2017；9(1)：19
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22公开了在大肠埃希杆菌(Escherichia coli)中过表达特里帕肽(1
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34)，其是人甲状旁腺激素(PTH)的重组生物活性部分。
[0015]本专利技术的专利技术人在努力将重组治疗性肽的表达提高数倍的过程中，提出了一种短N
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末端延伸序列的使用方法，该序列在上述现有技术中未公开。
[0016]专利技术目的
[0017]本专利技术的目的是提供治疗性肽的数倍高水平表达。

技术实现思路

[0018]本专利技术提供了N
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末端延伸序列、核酸、载体和重组宿主细胞，用于高效生产生物活性肽，比如利拉肽。
[0019]本专利技术考虑了一种多维方法，通过提供一种表达构建体在宿主细胞中获得高产量的肽，比如利拉肽，其中在该表达构建体中，编码利拉肽的核酸可操作地融合至编码TEV(Tobacco Etch Virus，烟草蚀刻病毒)切割位点和N
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末端延伸序列(NE
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3)的修饰的基因序列。
[0020]本专利技术提供了如SEQ ID NO:1中示出的N
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末端延伸序列(NE
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3)，以增强治疗性肽在细菌或酵母中的表达。
[0021]本专利技术还提供了用于高水平表达利拉肽的表达载体和重组宿主细胞，其中该表达载体包括编码N
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末端延伸序列NE
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3的修饰的基因序列、编码TEV(Tobacco Etch Virus，烟草蚀刻病毒)切割位点的修饰的基因序列和编码利拉肽的修饰的基因序列。
附图说明
[0022]图1A：没有N
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末端延伸序列的表达盒的示意图。
[0023]图1B：具有N
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末端延伸序列(NE1)的表达盒的示意图。
[0024]图1C：具有N
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末端延伸序列(NE3)的表达盒的示意图。
[0025]图2A：没有N
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末端延伸序列的表达质粒。
[0026]图2B：具有N
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末端延伸序列
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1(NE1)的表达质粒。
[0027]图2C：具有N
‑
末端延伸序列
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3(NE3)的表达质粒。
[0028]图3：通过ELISA的利拉肽表达。
[0029]图4：利拉肽的细胞干重。
[0030]序列表的描述
[0031]SEQ ID NO:1(N
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末端延伸序列NE
‑
3的氨基酸序列)
[0032]EEQAE
[0033]SEQ ID NO:2(修饰的TEV切割位点的氨基酸序列)
[0034]ENLYFQ
[0035]SEQ ID NO:3(利拉肽的氨基酸序列)
[0036]HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG
[0037]SEQ ID NO:4(毕赤酵母(Pichia pastoris)的编码N
‑
末端延伸NE
‑
3序列的核酸序列)
[0038]gaagaacaagccgaa
[0039]SEQ ID NO:5(毕赤酵母的编码修饰的TEV切割位点的核酸序列)
[0040]gagaacttgtacttccaa
[0041]SEQ ID NO:6(毕赤酵母的编码利拉肽的核酸序列)
[0042]cacgctgagggtacttttacctctgacgtgtcctcttacttggagggtcaagctgccaaagagttcattgcctggttggttagaggtagaggttag
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列的N
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末端延伸序列。2.根据权利要求1所述的编码N
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末端延伸序列的核酸。3.根据权利要求2所述的核酸，其中所述核酸选自包括SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:13的组中。4.一种包括根据权利要求3所述的修饰的核酸的载体。5.根据权利要求4所述的载体，其中所述载体为pD912。6.根据权利要求4所述的载体，其中所述载体包括选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:14的组中的修饰的TEV切割位点。7.一种用于利拉肽的重组表达的载体，包括：a、编码N
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末端延伸序列(NE
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3)的修饰的基因序列，所述修饰的基因序列选自包括SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:13的组中；b、编码TEV(烟草蚀刻病毒)切割位点的修饰的基因序列，所述修饰的基因序列选自包括SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:14的组中；和c、编码利拉肽的修饰的基因序列，所述修饰的基因序列选自包括SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:15的组中。8.根据权利要求7所述的载体，其中所述载体被修饰，以在毕赤酵母中高水平表达利拉肽，所述载体包括：a、编码所述N
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末端延伸序列(NE
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3)的修饰的基因序列，所述修饰的基因序列包括SEQ ID NO:4的核苷酸序列；b、编码TEV(烟草蚀刻病毒)切割位点的修饰的基因序列，所述修饰的基因序列包括SEQ ID NO:5的核苷酸序列；和c、编码利拉肽的修饰的基因序列，所述修饰的基因序列包括SEQ ID NO:6的核苷酸序列。9.根据权利要求7所述的载体，其中所述载体被修饰，以在谷氨酸棒杆菌中高水平表达利拉肽，所述载体包括：a、编码所述N
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末端延伸序列(NE
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3)的修饰的基因序列，所述修饰的基因序列包括SEQ ID NO:7的核苷酸序列；b、编码TEV(烟草蚀刻病毒)切割位点的修饰的基因序列，所述修饰的基因序列包括SEQ ID NO...

【专利技术属性】
技术研发人员：拉梅什，
申请(专利权)人：生物E有限公司，
类型：发明
国别省市：