一株高产麦角甾醇的酿酒酵母工程菌株、构建方法及应用技术

本发明专利技术公开一株高效产麦角甾醇的酿酒酵母工程菌株，所述酿酒酵母工程菌株是在酿酒酵母宿主中过表达SEQ ID NO.1所示的脂质转运蛋白基因SEC14基因构建得到的，脂质转运蛋白基因SEC14的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，其所编码的的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。本发明专利技术所构建的酿酒酵母工程菌株所含麦角甾醇为酵母菌干重的0.95％

【技术实现步骤摘要】
一株高产麦角甾醇的酿酒酵母工程菌株、构建方法及应用


[0001]本专利技术属于生物
，尤其是一株高产麦角甾醇的酿酒酵母工程菌株、构建方法及应用。

技术介绍

[0002]麦角甾醇，又称麦角固醇，是一种28碳甾族化合物，广泛存在于酵母中，是真菌细胞膜的重要组成成分，对确保细胞活力、膜的流动性、膜结合酶的活性、膜的完整性以及细胞物质运输等起着重要作用。麦角甾醇是一种重要的医药化工原料，用于生产“可的松”、“激素黄体酮”等甾醇类药物。麦角甾醇也是维生素D2的前体，经紫外线照射后可得到维生素D2。在医药工业上，维生素D2是预防和治疗佝偻病、龋齿及老年骨质疏松症的重要药品。维生素D2还可以作为饲料添加剂添加在饲料中，增加畜禽的产蛋率和孵化率。
[0003]目前，国内外用于生产麦角甾醇的酵母菌种主要采用以下四种选育方法获得：自然选育、常规选育、杂交法、原生质体融合法。上述四种技术均存在明显的不足之处。自然选育是从不同酵母菌种进行筛选。研究发现，对不同种、属的酵母菌的麦角甾醇的含量进行分析，不同种、属间差异很多，该方法工作量大且耗时长。常规选育是用诱变剂对菌株进行处理。这种方法可以直接获得高产麦角甾醇的菌株，但诱变选育的随机性大，结果具有不确定性。采用杂交法和原生质体融合法可以将不同菌株的优良性状结合起来，能获得生物量和麦角甾醇含量都较高的菌株。但研究发现，在这些酵母细胞中还含有2wt％左右的麦角甾醇前体物24(28)
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脱氢麦角甾醇存在。若24(28)
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脱氢麦角甾醇不能进一步转化为麦角甾醇，则酵母细胞内的麦角甾醇含量将不能被有效提升。
[0004]我国麦角甾醇年产量不能满足消费者的需求，需要从国外进口，但从总体来看，我国对麦角甾醇的需求量呈逐年上升的趋势。因此，本领域迫切需要开发一种有效提升细胞内麦角甾醇含量的菌株。
[0005]通过检索，发现如下两篇与本专利技术专利申请相关的专利公开文献：
[0006]1、一种可动态调控7
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脱氧胆固醇及维生素D3的酿酒酵母菌的构建方法及应用(CN113025512A)，所述构建方法包括以下步骤：S1、使用启动子GAL7控制酿酒酵母工程菌种mot3基因的表达，转化入原始酵母菌中构建第一酿酒酵母菌；S2、构建麦角甾醇动态调控的dCas9系统并提取构建的质粒；S3、人工合成融合基因片段gal80F
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loxT
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PTEF1
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DHCR24
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Tcyc1
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PGAP
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DIC
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TADH1
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gal80R，将其转化进入第一酿酒酵母菌，PCR验证后获得第二酿酒酵母菌；S4、将步骤S3中构建的质粒转化进入第二酿酒酵母菌中，经筛选后获得可动态调控生产7
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DHC的酿酒酵母菌。本专利技术所提供的构建方法构建的酿酒酵母菌，通过在不影响菌株生长状态的同时，利用酿酒酵母内源的甾醇调控系统，结合dCas9系统实现副产物的减少，7
‑
DHC的产量提升。
[0007]2、一种产生菜籽甾醇的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用(CN110903993A)，所述酿酒酵母工程菌含有甾醇Δ7
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还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因。本专利技术提供的酿酒酵母工程菌能够将麦角甾醇还原成菜籽甾醇。在本专利技术中，所述酿酒酵母工程菌中共表达甾醇
Δ7
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还原酶和葡萄糖脱氢酶，就可以葡萄糖脱氢酶形成的NADPH作为辅因子，利用甾醇Δ7
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还原酶将酿酒酵母固有的麦角甾醇还原成菜籽甾醇，从而达到生物制备菜籽甾醇的目的。
[0008]通过对比，本专利技术专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同。

技术实现思路

[0009]本专利技术目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一株高产麦角甾醇的酿酒酵母工程菌株、构建方法及应用。
[0010]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0011]一株高效产麦角甾醇的酿酒酵母工程菌株，所述酿酒酵母工程菌株是在酿酒酵母宿主中过表达SEQ ID NO.1所示的脂质转运蛋白基因SEC14基因构建得到的，脂质转运蛋白基因SEC14的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，其所编码的的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
[0012]进一步地，所述工程菌株在构建时所采用的表达载体为pRS426，所采用的宿主菌为酿酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)BY4741。
[0013]进一步地，所述工程菌株在构建时构建了包含HA
‑
tag的SEC14融合基因。
[0014]如上所述的酿酒酵母工程菌株的构建方法，包括以下步骤：
[0015](1)将SEQ ID NO.1所示的SEC14基因与HA
‑
tag构建融合基因至表达载体pRS426中；
[0016](2)对构建的表达载体采用醋酸锂转化法转入酿酒酵母BY4741进行表达；
[0017](3)通过尿嘧啶营养缺陷型(
‑
ura)固体酵母培养基筛选，能够在尿嘧啶营养缺陷型(
‑
ura)固体培养基上生长出的单菌落，即得到单克隆重组菌株。
[0018]如上所述的酿酒酵母工程菌株的构建方法，包括以下步骤：
[0019](1)将SEQ ID NO.1所示的SEC14基因与3HA即HA
×
3构建融合基因；
[0020](2)以质粒pYX212为模板，进行PCR扩增，得到P
TPI1
启动子；
[0021](3)将融合基因和P
TPI1
启动子与载体pRS426连接，构建含有SEC14基因的重组质粒；
[0022](4)对构建的重组质粒采用醋酸锂转化法导入酿酒酵母BY4741中进行表达；
[0023](5)在尿嘧啶营养缺陷型(
‑
ura)固体培养基上得到高表达SEC14的BY4741/pRS426
‑
P
TPI1
‑
SEC14
‑
3HA菌株，即得。
[0024]如上所述的酿酒酵母工程菌株在生产麦角甾醇中的应用。
[0025]利用如上所述的酿酒酵母工程菌株发酵生产麦角甾醇的方法，步骤如下：
[0026]将酿酒酵母工程菌划线于尿嘧啶营养缺陷型(
‑
ura)固体培养基平板上，28～30℃培养48
‑
72h，将活化后的菌种，接1
‑
2环于装有3
‑
5mL尿嘧啶营养缺陷型(
‑
ura)液体培养基的试管中，28～30℃，180
‑
220rpm条件下培养12
‑
16h即为种子培养液，将种子培养液按2
‑
10％接种量接入本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株高效产麦角甾醇的酿酒酵母工程菌株，其特征在于：所述酿酒酵母工程菌株是在酿酒酵母宿主中过表达SEQ ID NO.1所示的脂质转运蛋白基因SEC14基因构建得到的，脂质转运蛋白基因SEC14的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，其所编码的的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。2.根据权利要求1所述的高效产麦角甾醇的酿酒酵母工程菌株，其特征在于：所述工程菌株在构建时所采用的表达载体为pRS426，所采用的宿主菌为酿酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)BY4741。3.根据权利要求2所述的高效产麦角甾醇的酿酒酵母工程菌株，其特征在于：所述工程菌株在构建时构建了包含HA
‑
tag的SEC14融合基因。4.如权利要求1至3任一项所述的酿酒酵母工程菌株的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)将SEQ ID NO.1所示的SEC14基因与HA
‑
tag构建融合基因至表达载体pRS426中；(2)对构建的表达载体采用醋酸锂转化法转入酿酒酵母BY4741进行表达；(3)通过尿嘧啶营养缺陷型固体酵母培养基筛选，能够在尿嘧啶营养缺陷型固体培养基上生长出的单菌落，即得到单克隆重组菌株。5.如权利要求1至3任一项所述的酿酒酵母工程菌株的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)将SEQ ID NO.1所示的SEC14基因与3HA即HA
×
3构建融合基因；(2)以质粒pYX212为模板，进行PCR扩增，得到P
TPI1
启动子；(3)将融合基因和P
TPI1
启动子与载体pRS426连接，构建含有SEC14基因的重组质粒；(4)对构建的重组质粒采用醋酸锂转化法导入酿酒酵母BY4741中进行表达；(5)在尿嘧啶营养缺陷型固体培养基上得到高表达SEC14的BY4741/pRS426
‑
P
TPI1
‑
SEC14
‑
3HA菌株，即得。6.如权利要求1至3任一项所述的酿酒酵母工程菌株在生产麦角甾醇中的应用。7.利用如权利要求1至3任一项所述的酿酒酵母工程菌株发酵生产麦角甾醇的方法，其特征在于：步骤如下：将酿酒酵母工程菌划线于尿嘧啶营养缺陷型固体培养基平板上，28～30℃培养48
‑
72h，将活化后的菌种，接1
‑
2环于装有3
‑
5mL尿嘧啶营养缺陷型液体培养基的试管中，28～30℃，180
‑
220rpm条件下培养12

【专利技术属性】
技术研发人员：王敏，屠琳娜，王雪薇，孔繁萌，杜娟，申雁冰，郑宇，宋佳，夏梦雷，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：