液相芯片法杂交缓冲液、配制方法及液相芯片检测方法技术

本发明专利技术属于液相芯片领域，公开了一种液相芯片法杂交缓冲液，具体是一种适用于液相芯片法多重核酸检测的杂交缓冲液，并提供配制方法和利用该杂交缓冲液进行液相芯片检测的方法，该液相芯片法杂交缓冲液成分简单，容易配制，在针对低温不析出晶体的要求上改进后，调整了传统液相芯片法杂交缓冲液中TMAC的浓度，并加入了液相芯片法杂交缓冲液中未用过的氯化铵，意外地发现了该液相芯片法杂交缓冲液在针对多重PCR样本的检测中能降低背景信号，提高杂交反应灵敏度。交反应灵敏度。交反应灵敏度。

【技术实现步骤摘要】
液相芯片法杂交缓冲液、配制方法及液相芯片检测方法


[0001]本专利技术涉及一种液相芯片法杂交缓冲液、配制方法及液相芯片检测方法，属于液相芯片领域。

技术介绍

[0002]液相芯片又称悬浮阵列或流式荧光技术，其基本检测原理是以悬浮微球作为液相反应载体，以流式细胞术作为分析手段，通过红、绿两束激光检测微球编码荧光并报告分子荧光来达到定性和定量检测的目的。仅凭掺入不同比例的红色和橙色两种荧光染料，就可将微球分为100种以上不同的颜色，形成编码微球阵列，从而对多指标实现一次性高通量高密度分析。因此液相芯片技术在核酸、蛋白质等生物大分子的大规模检测中具有巨大的应用潜力。
[0003]使用液相芯片法进行核酸检测的流程包括：（1）核酸提取；（2）PCR扩增反应；（3）探针微球与PCR产物的杂交反应；（4）报告荧光分子孵育；（5）流式细胞仪或液相芯片仪上机检测。
[0004]在应用于多靶标核酸分子的检测中，多种靶基因在经过多重PCR扩增后，扩增产物与嫁接有不同寡核苷酸探针的编码微球之间的杂交反应效率对检测灵敏度具有重要影响。杂交效率除了与探针和靶标序列之间碱基互补配对的特异性有关外，还取决于杂交反应环境，即杂交缓冲液。
[0005]目前绝大多数文献资料中，液相芯片检测中所使用的杂交缓冲液配方源于液相芯片法的专利技术厂商，配方中包括4.5M 四甲基氯化铵（TMAC）、0.15% SDS（十二烷基硫酸钠）、75mM Tris（三羟甲基氨基甲烷）和6mM EDTA（乙二胺四乙酸）配制而成的1.5
×/>杂交缓冲液，50μl杂交反应体系中包含1.5
×
杂交缓冲液33μl、Tris
‑
EDTA（pH = 8）缓冲液12μl以及PCR产物5μl。
[0006]该配方存在以下缺点：一、配制过程中加入的SDS在缓冲液中极难溶解。二、杂交缓冲液总离子浓度较高，在温度低于10℃的环境下容易产生结晶析出，造成使用困难。
[0007]目前尚未有针对液相芯片法杂交缓冲液进行筛选优化的相关报道，杂交检测灵敏度还有待进一步提高。

技术实现思路

[0008]为了克服现有技术的不足，本专利技术提供一种液相芯片法杂交缓冲液，具体是一种适用于液相芯片法多重核酸检测的杂交缓冲液，并提供配制方法和利用该杂交缓冲液进行液相芯片检测的方法，该液相芯片法杂交缓冲液配制方法简单，且能够在低温下使用。
[0009]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：第一方面，本申请提供一种液相芯片法杂交缓冲液，溶质仅含有氯化铵和四甲基氯化铵。
[0010]本申请提供的液相芯片法杂交缓冲液容易配制，低温下不易析出晶体，另外还具
有提高杂交反应灵敏度的效果。
[0011]进一步地，所述的液相芯片法杂交缓冲液的溶液为水。
[0012]进一步地，应用于液相芯片杂交反应时，所述四甲基氯化铵在体系中的最终浓度为1mol/L
‑
2mol/L。专利技术人也尝试过使用更高浓度的TMAC（＞2M，1M=1mol/L），但由于TMAC粘度较大，杂交后磁性分离会造成大量微球损失，影响微球荧光计数统计分析。
[0013]进一步地，应用于液相芯片杂交反应时，所述四甲基氯化铵在体系中的最终浓度为1mol/L
‑
1.75mol/L。
[0014]进一步地，应用于液相芯片杂交反应时，所述四甲基氯化铵在体系中的最终浓度为1.5mol/L
‑
1.75mol/L。最优选为1.75M，能使结果具有最低的背景信号。
[0015]进一步地，应用于液相芯片杂交反应时，所述氯化铵在体系中的最终浓度为0.25mol/L
‑
1mol/L。专利技术人也尝试过使用没有TMAC的2M NH4Cl做实验，结果背景信号尚可，但对于某些指标得到的阳性结果差，因此TMAC和NH4Cl两种成分缺一不可。
[0016]进一步地，应用于液相芯片杂交反应时，所述氯化铵在体系中的最终浓度为0.25mol/L
‑
0.5mol/L。最优选为0.25M，能使结果具有最低的背景信号。
[0017]进一步地，所述液相芯片法杂交缓冲液为浓缩液。
[0018]进一步地，所述液相芯片法杂交缓冲液杂交缓冲液为1.5
×
浓缩液。
[0019]第二方面，本申请提供一种液相芯片法杂交缓冲液的配制方法，步骤包括：将氯化铵溶解于纯净水中，得到氯化铵溶液；将所述氯化铵溶液与四甲基氯化铵溶液混合，得到溶质仅含有氯化铵和四甲基氯化铵的液相芯片法杂交缓冲液。配制过程简单，得到的液相芯片法杂交缓冲液低温下不易析出晶体，另外还具有提高杂交反应灵敏度的效果。
[0020]第三方面，本申请提供一种液相芯片检测方法，步骤包括：核酸提取
‑
PCR扩增反应
‑
探针微球与PCR产物的杂交反应
‑
报告荧光分子孵育
‑
用流式细胞仪或液相芯片仪检测，所述探针微球与PCR产物的杂交反应的步骤包括：将第一方面所述的液相芯片法杂交缓冲液与探针微球溶液混合，然后加入PCR产物，混合均匀得到杂交反应体系，将所述杂交反应体系放入分子杂交设备中杂交。该液相芯片检测方法中应用了溶质仅含有氯化铵和四甲基氯化铵的液相芯片法杂交缓冲液，能够提高反应灵敏度。其中分子杂交设备为PCR仪或分子杂交炉。
[0021]本专利技术的有益效果是：本专利技术的液相芯片法杂交缓冲液成分简单，容易配制，在针对低温不析出晶体的要求上改进后，调整了传统液相芯片法杂交缓冲液中TMAC的浓度，并加入了液相芯片法杂交缓冲液中未用过的氯化铵，意外地发现了该液相芯片法杂交缓冲液在针对多重PCR样本的检测中能降低背景信号，能够提高杂交反应灵敏度。
附图说明
[0022]图1是对比组合1中使用常规杂交缓冲液和本专利技术杂交缓冲液测试空白样本产生的背景信号柱状图。
[0023]图2是对比组合1中使用常规杂交缓冲液和本专利技术杂交缓冲液测试低模板浓度样本产生的柱状图。
[0024]图3是对比组合1中使用常规杂交缓冲液和本专利技术杂交缓冲液测试高模板浓度样本产生的柱状图。
[0025]图4是对比组合1中使用常规杂交缓冲液和本专利技术杂交缓冲液测试低模板浓度样本信号与背景信号的比值的柱状图。
[0026]图5是对比组合2中使用三种杂交缓冲液测试空白样本产生的背景信号柱状图。
[0027]图6是对比组合2中使用三种杂交缓冲液测试低模板浓度样本产生的柱状图。
[0028]图7是对比组合2中使用三种杂交缓冲液测试高模板浓度样本产生的柱状图。
[0029]图8是对比组合2中使用三种杂交缓冲液测试低模板浓度样本信号与背景信号的比值的柱状图。
[0030]图9是对比组合3中使用C、D、E、F四组杂交缓冲液测试空白样本产生的背景信号柱状图。
[0031]图10是对比组合3中使用C、D、E、F四组杂交缓冲液本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种液相芯片法杂交缓冲液，其特征在于，溶质仅含有氯化铵和四甲基氯化铵。2.根据权利要求1所述的液相芯片法杂交缓冲液，其特征在于，应用于液相芯片杂交反应时，所述四甲基氯化铵在体系中的最终浓度为1mol/L
‑
2mol/L。3.根据权利要求2所述的液相芯片法杂交缓冲液，其特征在于，应用于液相芯片杂交反应时，所述四甲基氯化铵在体系中的最终浓度为1mol/L
‑
1.75mol/L。4.根据权利要求3所述的液相芯片法杂交缓冲液，其特征在于，应用于液相芯片杂交反应时，所述四甲基氯化铵在体系中的最终浓度为1.5mol/L
‑
1.75mol/L。5.根据权利要求1所述的液相芯片法杂交缓冲液，其特征在于，应用于液相芯片杂交反应时，所述氯化铵在体系中的最终浓度为0.25mol/L
‑
1mol/L。6.根据权利要求5所述的液相芯片法杂交缓冲液，其特征在于，应用于液相芯片杂交反应时，所述氯化铵在体系中的最终浓度为...

【专利技术属性】
技术研发人员：顾桐旭，褚春旭，钟嘉俊，白鹏利，王哲，
申请(专利权)人：季华实验室，
类型：发明
国别省市：