一种外周血DMARDs耐药相关的标志物的筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种外周血DMARDs耐药相关的标志物的筛选方法，属于生物医学技术领域，步骤为：通过生物信息学方法初步筛选与RA治疗药物耐药相关的外周血标志物；利用临床样本对初步筛选的耐药标志物进行验证，明确其表达水平与药物治疗敏感性之间的关系；采用流式细胞技术分离外周血细胞中不同有核细胞亚群，对不同亚群细胞进行耐药标志物表达量检测，建立RA药物治疗耐药标志物检测方法；选取临床未接受药物治疗的RA患者进行前瞻性实验验证，验证已建立检测方法的有效性，明确其转化临床应用的可行性。本发明专利技术保证了候选标志物的可靠性，以患者外周血为样本建立有效简单的RA耐药标志物检测方法，并以前瞻性实验验证其可靠性。并以前瞻性实验验证其可靠性。并以前瞻性实验验证其可靠性。

A screening method of drug resistance related markers of DMARDs in peripheral blood

【技术实现步骤摘要】
一种外周血DMARDs耐药相关的标志物的筛选方法


[0001]本专利技术涉及生物医学
，特别涉及一种外周血DMARDs耐药相关的标志物的筛选方法。

技术介绍

[0002]RA，rheumatoid arthritis是一种影响关节的慢性自身免疫性疾病。其主要临床特点是受累关节的进行性对称性炎症改变，从而导致软骨破坏，骨质侵蚀，进而影响机体正常运动机能。RA早期只受累少数远端关节，但随着病情的进展，全身关节均可发生不同程度的病理变化，并伴发多种关节外症状。据统计，全球RA的发病率在0.3％到1.3％，我国RA发病率接近0.4％，其发病率随性别(RA在女性中的发病率大约是男性的3倍)，居住环境(北方高于南方，城市高于农村)有显著相关性。目前，RA是最普遍的慢性炎症疾病之一。早期RA的临床特征多为全身性症状，如疲劳、流感样症状、关节肿胀触痛和晨僵，如果得不到及时有效的干预治疗，随着病情进展会出现多种其他关节外症状，如胸膜腔积液、肺结节、间质性肺、淋巴瘤、中小动脉血管炎、角结膜炎、动脉粥样硬化、血液学异常(例如，贫血、白细胞减少症、中性粒细胞减少症、嗜酸性粒细胞增多症、血小板增多症等)、关节运动受限、骨质侵蚀、软骨破坏、致残等。由此可见，在RA早期进行诊断并接受有效临床治疗的重要性。
[0003]RA的诊断主要依据患者临床表现和影像学及实验室检查结果，患者被诊断为RA后应立即进行有效的干预，总体治疗目标是在大约6个月的时间内达到完全缓解或至少显着降低疾病活动度，以预防RA的关节损伤、残疾和全身表现。据统计，80％未接受合理干预的RA患者会出现关节错位，40％的患者在疾病发作后10年内无法从事日常工作，这更凸显了及时有针对性治疗的重要性。
[0004]目前的改善病情抗风湿药(DMARD，disease
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modifying anti
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rheumatic drug)主要包括传统常规合成DMARDs(甲氨蝶呤、氢氯喹和磺胺嘧啶等)，靶向合成DMARDs(pan
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JAK
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和JAK1/2
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抑制剂)和生物DMARDs(TNF抑制剂、白细胞介素6抑制剂、B细胞耗竭抗体、T细胞共刺激因子抑制剂)，其中生物DMARDs主要用于常规合成DMARDs治疗无效的难治性RA患者。
[0005]TNF抑制剂是传统常规合成DMARDs失败后使用的首选生物制剂，目前临床应用的TNF抑制剂包括阿达木单抗、赛妥珠单抗聚乙二醇、依那西普、戈利木单抗和英夫利昔单抗。作为第一个在临床上批准使用的生物DMARDs，TNF
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抑制剂可以有效缓解RA症状，并能显著降低RA的致残率。然而，并不是所有接受TNF
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抑制剂治疗的RA患者临床症状都能得到显著的改善，大约30
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40％的患者会发生原发或继发性耐药，还有少数患者因药物不耐受而被迫停止TNF
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抑制剂治疗。虽然TNF
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抑制剂耐药患者可以换其他种类的TNF
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抑制剂继续治疗，但由于各种TNF
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抑制剂均为相似的药物作用机理，耐药发生几乎不可避免。白细胞介素6抑制剂和T细胞共刺激因子抑制剂也是目前临床治疗传统合成DMARDs难治性RA一线的生物DMARDs，与TNF抑制剂类似，并非所有RA患者在接受这两类DMARDs后临床症状可以得到明显的缓解，而且在某些情况下，接受这两类药物治疗的RA患者会出现感染和中性粒细胞缺乏等不良反应。B细胞耗竭抗体最初用于治疗B细胞淋巴瘤，是一种针对CD20的嵌合IgG1单克
隆抗体，可以通过补体和抗体介导的细胞毒性诱导B细胞耗竭，已经被批准用于治疗对TNF
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抑制剂治疗耐药的难治性RA患者。临床试验表明，在使用TNF
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抑制剂初始治疗失败后改用B细胞耗竭抗体明显优于改用另一种TNF抑制剂继续治疗。虽然几乎所有的RA患者均能耐受B细胞耗竭抗体治疗，但也不可避免发生治疗相关的不良反应，B细胞耗竭抗体的副作用包括感染、输液反应、神经系统疾病、胃肠道疾病和牛皮癣等。与TNF
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抑制剂类似，并非所有RA患者均对B细胞耗竭抗体治疗敏感，40％到50％的RA患者在接受B细胞耗竭抗体治疗后RA临床症状并无显著改善。
[0006]由于部分RA患者对一种或多种DMARDs治疗耐药，而且两类药物均存在多种治疗相关不良反应。因此，临床上急需可靠的药物敏感性标志物，实现RA个体化药物治疗，提高药物治疗的针对性。目前临床应用的RA实验室指标，如C反应蛋白，血沉，类风湿因子(RF)抗环瓜氨酸肽抗体(CCP)等在诊断和评估RA活动性方面具有临床指导意义，但还没有证据表明这些实验室指标可以判断RA患者对抗RA药物治疗的敏感性。
[0007]有研究表明，在RA患者滑膜组织中，白细胞介素7受体α链(IL
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7R)，趋化因子配体11(CXCL11)、IL
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18、IL
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18受体附着成分(IL
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18rap)等基因的表达水平与TNF
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抑制剂耐药有关，但仍处于起始阶段。有关白细胞介素6抑制剂和T细胞共刺激因子抑制剂的耐药机制研究也与TNF
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抑制剂相关研究类似，加之滑膜组织临床上取样困难，同时会对患者造成不必要的损伤，因此难以实现临床转化。通过对接受B细胞耗竭抗体治疗RA患者外周血进行基因表达高通量筛选，某些基因的表达量变化与B细胞耗竭抗体耐药相关，但不同研究中得到的结论不尽相同。目前所有关于抗RA治疗药物耐药标志物的研究仅限于筛选阶段，还没有任何标志物得到临床的验证，而且缺少有效方便的方法来提高特定标志物的检出率。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于提供一种外周血DMARDs耐药相关的标志物的筛选方法，利用生物信息学对临床外周血样本进行标志物筛选，并以临床样本进行再次验证确认，保证了候选标志物的可靠性，以流式细胞技术和荧光定量PCR技术为基础，以患者外周血为样本建立有效简单的RA耐药标志物检测方法，并以前瞻性实验验证其可靠性，明确转化临床应用的可行性，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0009]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0010]一种外周血DMARDs耐药相关的标志物的筛选方法，包括如下步骤：
[0011]步骤1：筛选生物制剂DMARDs药物治疗耐药标志物，通过生物信息学方法初步筛选与RA治疗药物耐药相关的外周血标志物；
[0012]步骤2：候选标志物临床样本验证，利用临床样本对初步筛选的耐药标志物进行验证，明确其表达水平与药物治疗敏感性之间的关系；
[0013]步骤3：建立药物敏感性标志物检测方法，采用流式细胞技术分离外周血细胞中不同有核细胞亚群，对不同亚群细胞进行耐药标志物表达量检测，建立RA药物治疗耐药标志物检测方法，并优化标志物检出效率；...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种外周血DMARDs耐药相关的标志物的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：筛选生物制剂DMARDs药物治疗耐药标志物，通过生物信息学方法初步筛选与RA治疗药物耐药相关的外周血标志物；步骤2：候选标志物临床样本验证，利用临床样本对初步筛选的耐药标志物进行验证，明确其表达水平与药物治疗敏感性之间的关系；步骤3：建立药物敏感性标志物检测方法，采用流式细胞技术分离外周血细胞中不同有核细胞亚群，对不同亚群细胞进行耐药标志物表达量检测，建立RA药物治疗耐药标志物检测方法，并优化标志物检出效率；步骤4：药物敏感性标志物检测方法临床验证，选取临床未接受药物治疗的RA患者进行前瞻性实验验证，验证已建立检测方法的有效性，明确其转化临床应用的可行性。2.如权利要求1所述的外周血DMARDs耐药相关的标志物的筛选方法，其特征在于，步骤1的具体步骤为：GEO数据库筛选接受生物制剂DMARDs药物治疗RA患者外周血基因表达谱芯片，分别对不同生物制剂DMARDs药物治疗后临床缓解症状为标准，区分耐药组与敏感组，并利用生物信息学方法筛选不同组别中耐药患者与敏感患者外周血中表达水平具有显著差异的基因，通过互作分析、免疫细胞浸润分析、以及基因功能分析筛选出关键节点基因为候选耐药相关标志物。3.如权利要求2所述的外周血DMARDs耐药相关的标志物的筛选方法，其特征在于，对RA治疗药物耐药特征性芯片数据进行标准化转换并进行差异分析，差异标准选取log2 FC>1,p<0.05，对所有满足差异筛选标准的基因进行基因功能富集分析，并利用生物信息学工具进行蛋白互作分析，并采用三种模式进行关键节点基因筛选，三种算法均取排名前30个基因为关键节点基因并对其进行合成分析，选择所有算法重叠基因为初步筛选标志物。4.如权利要求1所述的外周血DMARDs耐药相关的标志物的筛选方法，其特征在于，步骤2的具体步骤为：对候选标志物进行临床样本验证，以临床接受DMARDs治疗RA患者外周血为样本，采用荧光定量PCR方法对候选标志物进行基因扩增，通过对比治疗药物敏感性不同的患者，验证候选基因的可靠性，对通过验证的候选基因进行表达量分析，...

【专利技术属性】
技术研发人员：王秋波，刘庆阳，钱希铭，殷剑，褚莹，姜风英，
申请(专利权)人：无锡市第九人民医院，
类型：发明
国别省市：