一种高稳定性固定化酶的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种高稳定性固定化酶的制备方法，在按照常规方法制备的粗酶液中加入氨基树脂LXTE

【技术实现步骤摘要】
一种高稳定性固定化酶的制备方法


[0001]本专利技术属于酶工程
，具体涉及一种高稳定性固定化酶的制备方法。

技术介绍

[0002]酶作为重要的催化剂已经在食品、医药化工等领域广泛应用。相较于游离酶，固定化酶具有更好的工艺适应性，即更好的耐热性、试剂耐受性、可方便固液相分离及可回收重复利用等特性。因此，固定化酶已然成为现代工业催化领域中不可或缺的绿色催化剂。
[0003]固定化酶制备方法一般包括吸附法、共价结合法、交联法及包埋法。其中，吸附法利用载体与酶分子之间范德华力作用结合，使用过程中容易导致酶的脱落；共价结合法在载体与酶分子之间有共价键的形成，多次使用后酶也不易脱落；交联法则利用蛋白质交联剂，如戊二醛等在酶分子间形成共价键，进而将游离“单体酶”转变成具有三维结构的“多聚体酶”，进而增加酶的稳定性。而包埋法则利用物理包围方式，将酶分子包裹，使其活性中心不被破坏，同时具有相对坚固的机械物理防护。如专利CN113308457 A公开了一种在聚乙烯聚吡咯烷酮保护下，氨基配体与醛基配体反应形成有机骨架将酶分子包埋其中，该操作简单，但制备过程有强致癌化学物质二苯胺的参与，不利于生产应用。
[0004]以上现有固定化酶方法因利用原理、工艺各异及制备成本控制要求不同，在不同催化反应中均有规模化应用。但无论采用哪种制备方法，固定化酶的酶分子仍面临稳定性问题，常出现贮存失活，尤为严重的是在一些涉及高浓度有机试剂的重要的医药中间体合成过程随着使用批次增加底物转化率降低显著。
[0005]为解决酶失活问题，通常采用通过大量的基础实验，通过筛选不同的固定化方法以确定最优固定方法，如共价结合法中对不同的酶与载体进行固定化适配性优化以改善固定化酶的稳定性。如对选择不同的树脂种类、酶与载体配比等固定化过程进行参数优化。此外，对固定化酶做进一步的化学修饰也可以提高其稳定性。Hadjer Zaak等报道，利用聚乙烯亚胺和戊二醛进一步处理固定化脂酶，发现聚乙烯亚胺及戊二醛均可导致脂酶分子间形成共价键，进而在外围将脂酶分子包裹住，防止酶分子脱落，显著增加了吸附法制备的固定化脂酶的稳定性(Zaak H,Fernandez
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Lopez L,Otero C,et al.Improved stability of immobilized lipases via modification with polyethylenimine and glutaraldehyde[J].Enzyme and Microbial Technology,2017,106:67
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74.)。
[0006]生化研究表明，酶分子的空间结构对于酶的活性至关重要。通过定向进化技术对酶分子氨基酸种类进行改造是获得高稳定性酶的有效方法。比如，通过氨基酸的定向突变，改变酶的耐热性或其他抗性。其中，最为经典的是借助带有巯基的半胱氨酸成对的参入增加酶分子内部二硫键稳固酶的结构，进而提高其稳定性。但这种操作目前仍依赖于对蛋白质结构预测及耗时的突变体筛选过程，而且在引入多对二硫键以强化的过程中容易发生二硫键的错配，导致酶活性的大幅降低甚至丧失。中国专利CN 111117996A公开了一种固定化酶、其制备方法及应用，该方法采用聚乙二醇修饰戊二醛或醛基化右旋糖苷，最后形成分散有醛基、羟基的网状结构，通过共价键、离子键等作用力包裹酶，进而提升了酶的机械稳定
性。但此过程需要优化醛与聚乙二醇的比例，在聚乙二醇分子上接入活性基团，再与酶蛋白上基团形成共价键，其机械稳定性提升依赖于酶分子间聚合及聚乙二醇大分子与酶分子互作，酶分子自身骨架稳定性仍有较大的提升空间。
[0007]环氧基与蛋白质中氨基较容易发生加成反应，当环氧基数量大于1时，蛋白分子间形成共价键，进而进行聚合。因此，环氧基交联剂在羊毛或蚕丝加工中应用，如溶解后单体聚合的纺丝制膜过程(张玉荣,刘建勇,王洁.乙二醇二缩水甘油醚交联羊毛角蛋白[J].材料导报,2013,27:230
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232.)；也用来制备生物医学材料，如对血红蛋白进行分子交联，获得血红蛋白的功能性寡聚体，以期替代红细胞，同时，研究表明，环氧基化合物添加的浓度及反应体系的pH会影响蛋白质分子内还是分子间交联及其交联程度(徐宇红,路秀玲,郑春杨,等.乙二醇二缩水甘油醚交联血红蛋白的反应优化[J].高校化學工程學報,2006,20(3):401
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406.)。目前，利用环氧基与酶蛋白共价结合固定酶的方法尚未见报道。

技术实现思路

[0008]针对传统固定化酶稳定性问题，本专利技术公开一种高稳定性固定化酶的制备方法，通过对交联剂的复配使用，提高酶的稳定性。
[0009]具体来说，本申请专利技术目的是通过如下技术方案实现的：
[0010]一种高稳定性固定化酶的制备方法，其具体步骤如下：
[0011](1)酶液制备
[0012]利用含有目标酶基因的重组菌(如重组大肠杆菌)100g～200g湿重/L溶于缓冲液(甘氨酸
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NaOH缓冲液)经破碎、离心取上清，获得浓度为4.5～9U/ml的粗酶液；
[0013]本步骤粗酶液制备方法为本领域常规的酶液制备方法，如“魏东芝《酶工程》高等教育出版社，2020”书中公开的方法。
[0014](2)按照质量体积比(g/ml)1：4向氨基树脂LXTE
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700S中加入粗酶液，25℃，200rpm震荡混匀12h后，过滤获得LXTE
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700S@酶，备用；
[0015](3)按照质量体积百分比1:5
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10(g/ml)向LXTE
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700S@酶加入pH为8.0的硼酸缓冲液,再加入终浓度2mmol/L磷酸吡哆醛，震荡反应1h；最后加入长程交联剂和短程交联剂，37～55℃条件下震荡反应0.5～2.5h后抽滤，滤饼以纯水洗涤，即获得所述高稳定性固定化酶；
[0016]其中，长程交联剂的加入量为硼酸缓冲液体积的2
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6％；短程交联剂的加入量为LXTE
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700S@酶液酶液体积的的2
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6％，且所加入的长程交联剂与短程交联剂的体积不能均为LXTE
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700S@酶液体积的6％。
[0017]所述长程交联剂为环氧基交联剂为聚乙二醇二缩水甘油醚(215)；所述短程交联剂为乙二醇二缩水甘油醚(669)、丙三醇三缩水甘油醚(633)、1,6
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己二醇二缩水甘油醚(632)中的至少一种。
[0018]优选的，所加入的长程交联剂与短程交联剂体积比为1:3～3:1，如1:1、1:2、1:3、2:1或3:1。
[0019]本申请在常规固定化酶制备的缓冲液体系中，利用聚乙二醇二缩水甘油醚的两个环氧基与酶蛋白共价结合，通过长程及短程环氧基交联剂协同作用下封装并加固酶分子骨架，同时短程交联剂形成分子内共价键，进一步提升酶分子骨架的稳定性，显著提本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1. 一种高稳定性固定化酶的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：1）酶液制备利用含有目标酶基因的重组菌溶于缓冲液中，经破碎、离心取上清，获得浓度为4.5~9U/ml的粗酶液，备用；2）向氨基树脂LXTE
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700S中加入步骤1）获得的粗酶液，25℃，200rpm震荡混匀12h后，过滤，获得LXTE
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700S@酶，备用；3）向LXTE
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700S@酶中加入硼酸缓冲液,再加入终浓度为2mmol/L的磷酸吡哆醛，震荡反应1h；最后加入长程交联剂和短程交联剂，37~55℃条件下震荡反应0.5~2.5h后抽滤，滤饼即为所述高稳定性固定化酶；其中，长程交联剂的加入量为硼酸缓冲液体积的2
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6%；短程交联剂的加入量为LXTE
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700S@酶液酶液体积的的2
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6%，且所加入的长程交...

【专利技术属性】
技术研发人员：饶经纬，王海勇，岳永力，沈艳阳，鲁飞，林立，于冰，
申请(专利权)人：安庆朗坤药业有限公司，
类型：发明
国别省市：