复合磷脂脂质体中mPEG2000-DSPE、DOPE和M5三种磷脂含量的检测方法技术

本发明专利技术建立了一种HPLC－CAD法同时测定复合磷脂脂质体，尤其是COVID19 LPP疫苗中三种磷脂(mPEG2000

【技术实现步骤摘要】
复合磷脂脂质体中mPEG2000
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DSPE、DOPE和M5三种磷脂含量的检测方法


[0001]本专利技术涉及一种mRNA脂质体疫苗的质量控制方法，具体而言，涉及复合磷脂脂质体中同时检测mPEG2000
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DSPE、DOPE和M5三种磷脂含量的检测方法。

技术介绍

[0002]脂质体是指将药物包封于类脂质双分子层内形成的微型泡囊体，常用作抗肿瘤药物载体，现在已经发展成为成熟的一类新型靶向制剂。脂质体由于稳定性差使其发展受到限制，主要原因为磷脂在储存的过程中容易发生氧化分解；而磷脂并非单一的化合物，是基架结构相同但脂肪酸链不同的一类物质的混合物，由此限制了磷脂材料的检测。由于脂质体的成分比较复杂，常规脂质体中一般都包含胆固醇、磷脂等主要功能性辅料，而磷脂的降解产物及其本身的杂质又比较多且复杂，因此给脂质体中多种磷脂的检测工作带来一定的难度。
[0003]中国药典2010版中明确指出，注射剂所用的原辅料应从来源及工艺等生产环节进行严格控制并应符合注射用的质量要求。同时，根据药品质量行业标准，作为一种功能性药用辅料，磷脂在药物制剂中的含量需要被准确定量，而现有文献方法却十分复杂，给药物制剂研究带来了一定的困难。
[0004]磷脂的研究手段多样，目前测定磷脂含量的方法，主要有高效液相色谱法、钼蓝比色法、紫外分光光度法、荧光法、硫氰铁铵显色法、薄层色谱法、以及核磁共振法等。而在实际应用中，通常对特定磷脂的检测需要有特定的检测方法。CN101692038提供了一种比色法测定脂质体中磷脂的方法；研究者赵宝琴提供了钼蓝比色法对磷脂软胶囊中磷脂含量进行测定的方法(亚麻酸磷脂软胶囊中磷脂含量测定，人参研究，2015(03:36
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37))；龚金炎提供了一种测定卵磷脂中磷脂含量的硫氰铁铵显色法(硫氰亚铁铵比色法测定蛋黄卵磷脂中总磷脂含量，食品工业，2018,039(008):319
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322)，这些方法所用试剂涉及仪器种类多、操作步骤复杂，也不能对多种磷脂成分进行有效分离。Hatziantoniou S则采用薄层色谱法联合火焰离子检测器分离分析脂质体磷脂组成，但是流动相复杂，色谱峰形效果差(Method of simultaneous analysis of liposome components using HPTLC/FID[J].Methods in molecular biology，(Clifton,N.J.),2010,606(606):363
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368)。
[0005]HPLC是目前最常用的检测方法，高效液相色谱在磷脂的分离、检测方面具有优势，高效液相色谱分离磷脂可以避免破坏磷脂分子结构，得到更准确的分子结构信息。检测磷脂的检测器有紫外、蒸发光散射、示差折光、电雾式及质谱检测器。在已报道的磷脂HPLC 检测方法中多为紫外检测器检测，由于磷脂缺乏强发色团，紫外吸收性能差，其灵敏度低。亦可将磷脂分子进行衍生化，可增大磷脂的紫外吸收。通过化学反应将磷脂变成具有发色基团的化合物，或直接在磷脂分子上连接发色团或荧光基团，再用紫外或荧光检测器进行检测。但是衍生化反应过程复杂，前处理步骤繁琐，对定量结果的准确度影响较大，操作繁琐。杨亦文等研究发现紫外检测器受磷脂来源影响较大，难以实现准确定量(HPLC
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RI 法快速
15.0mL氯仿
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异丙醇(2:1)溶液和10.0mL乙醚
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乙酸混合溶液(72:1)淋洗小柱，再用15.0mL 甲醇洗脱；洗脱液用旋转蒸发在35℃条件下浓缩近干，加入正己烷
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异丙醇(2:3)混合溶液溶解定容至10mL，过0.45um滤膜然后才能上机检测，而且流动相配制过程也很复杂，A 为正己烷(含0.04％三乙胺)，B为异丙醇，C为13％乙酸水溶液。可见同时检测多种磷脂存在较大难度。
[0010]本研究小组曾在传统磷脂检测方法的基础上，结合自主开发的COVID19 LPP疫苗制剂(mRNA复合磷脂脂质体疫苗)的自身特点，开发了一种选择性好、简便快捷准确的 DOPE和M5含量同时测定的新方法，首次在复合磷脂脂质体中实现同时分离检测DOPE 和M5含量，并提出了CN2020109223212的专利申请。但是采用CN2020109223212的方法仍无法分离检测COVID19 LPP疫苗中的第三种磷脂成分mPEG2000
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DSPE，而且目前同时检测复合磷脂脂质体这一总体物质中的mPEG2000
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DSPE、DOPE和M5三种磷脂的方法也未见报道。

技术实现思路

[0011]为解决上述问题，本专利技术在传统磷脂检测方法的基础上，结合自主开发的COVID19 LPP疫苗制剂(mRNA复合磷脂脂质体疫苗)的自身特点，开发了一种选择性好、简便快捷准确的mPEG2000
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DSPE、DOPE和M5含量测定的新方法，首次在复合磷脂脂质体中实现同时分离检测mPEG2000
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DSPE、DOPE和M5三种磷脂的含量。
[0012]本专利技术所述的mPEG2000
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DSPE，中文名为聚乙二醇单甲醚
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2000
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二十八烷基磷脂酰乙醇胺，分子式为C
45
H
87
NNaO
11
P，分子量为872.1359，CAS号：147867
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65
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0，结构式如式Ⅰ所示。
[0013][0014]本专利技术所述的DOPE，中文名为二油酰基磷脂酰乙醇胺，分子式为C
41
H
78
NO8P，分子量为744.0337，CAS：4004
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05
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1，结构式如式Ⅱ所示。
[0015][0016]本专利技术所述的M5是一种中性磷脂，可用于疫苗试剂中的脂质成分，其结构式如式Ⅲ所示。
[0017][0018]复合磷脂脂质体中通常含有多种磷脂成分，如COVID19 LPP疫苗制剂，同时含有 mPEG2000
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DSPE、DOPE和M5三种磷脂，利用现有技术中的磷脂检测方法，操作过程复杂繁琐，却仍无法同时检测出mPEG2000
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DSPE、DOPE和M5三种，而且由于 mPEG2000
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DSPE的含量较低，检测难度进一步加大，使复合磷脂脂质体疫苗的质量控制面临较大的困难。因此如何快速有效地从复合磷脂脂质体中同时检测出mPEG2000
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DSPE、 DOPE和M5，是提高复合磷脂脂质体疫苗质量控制水平的基础。
[0019]但是由于磷脂的基架结构类似，再加上复合磷脂脂质体的成分比较复杂，以及磷脂的降解产物及其本身的杂质，mPEG2000
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DSPE、DOPE和M5的分离存在一定的难度。 COVID19 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高效液相色谱同时检测mPEG2000
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DSPE、DOPE和M5三种磷脂含量的方法，其特征在于，所述方法采用高效液相色谱
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电雾式检测器检测，流动相A为10mM醋酸铵溶液，流动相B为甲醇，进行梯度洗脱。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的梯度洗脱程序为：时间(min)流动相A(％)流动相B(％)01090100100140100151090201090。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的流动相A的配制方法为：称量醋酸铵7705mg到1L的溶剂瓶中，加入1000mL超纯水溶解超声15min；流动相B采用的甲醇为色谱级甲醇；所述的高效液相色谱条件为：色谱柱为C8色谱柱，流动相流速为1.0mL/min，柱温为35℃。4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的电雾式检测器检测条件为：蒸发温度35℃，Filter为3.6，Rate：5Hz。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括标准品制备，所述标准品制备包括mPEG2000
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DSPE、...

【专利技术属性】
技术研发人员：邱旭辉，李炜玮，孙宝来，赵国凤，张育坚，李航文，
申请(专利权)人：斯微上海生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：