一种室温形成荧光共聚物检测辣根过氧化物酶的方法及心肌钙蛋白I型检测的酶联免疫方法技术

本发明专利技术涉及一种室温形成荧光共聚物检测辣根过氧化物酶的方法及应用于心肌钙蛋白I型检测的酶联免疫方法，属于纳米生物传感技术领域。该方法包括：基于对苯二胺和聚乙烯亚胺在辣根过氧化物酶作用下生成绿色荧光共聚物来实现对辣根过氧化物酶的检测。此外，鉴于该酶在免疫分析中的广泛应用，我们利用其作为标记酶构建了一个检测心肌钙蛋白I型的免疫荧光传感平台。本发明专利技术中基于对苯二胺和聚乙烯亚胺的荧光共聚物纳米颗粒具有室温合成，步骤简单，荧光强等优点，所构建的免疫传感平台成功实现了在患有急性心肌梗死的病人血清样本中检测心肌钙蛋白I型，该实验结果与标准试剂盒一致，这表明我们设计的免疫荧光试剂盒在疾病诊断方面具有巨大的潜力。方面具有巨大的潜力。方面具有巨大的潜力。

【技术实现步骤摘要】
一种室温形成荧光共聚物检测辣根过氧化物酶的方法及心肌钙蛋白I型检测的酶联免疫方法


[0001]本专利技术涉及一种室温形成荧光共聚物检测辣根过氧化物酶的方法，基于辣根过氧化酶作用的新型荧光底物应用于心肌钙蛋白检测的酶联免疫方法及其应用，属于纳米


技术介绍

[0002]酶联免疫吸附试验(ELISA)主要基于抗原与抗体的特异性反应和酶的高效生物催化特性。由于它具有良好的准确性和实用性，低成本和高通量，在食品安全分析、环境监测和生物医学诊断中得到了广泛的应用。该方法通常使用一种酶，通常是辣根过氧化物酶(HRP)催化相应的底物转化为彩色或高荧光的定量产物。此外，辣根过氧化物酶也是研究最广泛的过氧化物酶家族成员。由于在水溶液中具有极高的稳定性，它在诊断、生物传感和生物技术等领域有着广泛的应用。因此，在这方面，制定一种方便的测量HRP活性的策略仍然是必要和重要的。
[0003]目前，检测HRP活性的方法有荧光法、比色法、电化学法和化学发光法等。相应的，在这些分析方法的基础上建立了一些免疫分析方法。在这些免疫分析中，比色免疫分析是实验室和工业/临床用于检测目标分析物的常规方法。然而，传统的比色ELISA存在检出限高的问题。为了解决这个困境，Shiddiky等人于2017年在Analytical Chemistry上研究了一种新型的比色免疫传感器。该传感器将含金纳米孔氧化铁纳米粒子和辣根过氧化物酶相偶联，以3，3，5，5
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四甲基联苯胺作为酶的底物，在双氧水存在下对卵巢上皮癌患者的自身抗体进行显色检测，甚至有望将其推广进一步检测其他疾病的生物标志物上。Zhang等人于2019年在Spectrochimica Acta Part A:Molecular and Biomolecular Spectroscopy上报道了一种用于人绒毛膜促性腺激素(hCG)检测的超灵敏比色生物传感器。该传感器将HRP与小鼠抗hcg单克隆抗体(gh
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submit,mAb1)共同固定在Au@Pt NP表面，提高催化效率和特异性，形成Au@Pt
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HRP双功能化探针，极大提高了比色法的检测限。然而，这些昂贵的纳米材料的合成和改性需要大量的时间。此外，贵金属纳米材料易受外部因素的影响。与此同时，荧光免疫分析法作为比色免疫分析法的替代或补充，越来越受到人们的关注。然而，让人感到遗憾的是，目前基于辣根过氧化物酶引发的荧光反应报道的很少。因此，探索辣根过氧化物酶的新型荧光底物和荧光反应在辣根过氧化物酶标记的免疫分析中具有十分重要的意义。
[0004]在此，我们在前期实验筛选中发现聚乙烯亚胺和对苯二胺能够在辣根过氧化物酶和双氧水作用下在室温快速形成荧光共聚物纳米颗粒(FCNPs)，这表明这两种物质能够作为辣根过氧化物酶的新型荧光底物。有意思的是，我们通过在对苯二胺结构基础上引入具有不同电子推拉能力的基团，还合成了不同波长的荧光共聚物纳米颗粒(FCNPs)。此外，鉴于辣根过氧化物酶在免疫分析中常作为标记酶的特性，我们以心肌钙蛋白I型作为靶向抗原并基于此构建了一个荧光免疫传感平台，并成功实现了在患有急性心肌梗死的病人血清
样本中检测到心肌钙蛋白I型，并与标准试剂盒进行对比。结果表明，我们研制的免疫传感器具有操作简单、成本低、信号产生简单等优点，在疾病诊断中具有很大的潜力。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于，为了克服现有技术的不足，寻找一种新的HRP催化的荧光底物，即对苯二胺和聚乙烯亚胺。一方面，利用HRP催化这两种物质生成荧光共聚物纳米颗粒(FCNPs)来检测HRP的活性；另一方面，又利用HRP在酶联免疫中作为标记酶的特性，以心肌钙蛋白I型为靶向抗原，构建了一个荧光免疫传感器。
[0006]本专利技术的技术方案之一是，一种室温原位形成荧光共聚物检测辣根过氧化物酶的方法，室温条件下，在Tris
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HCl缓冲溶液中，加入一定量的聚乙烯亚胺，对苯二胺，双氧水和不同浓度的辣根过氧化物酶，反应后生成强绿色FCNPs，并且FCNPs的荧光强度随着辣根过氧化物酶浓度的增加而逐渐增加，进而实现对辣根过氧化物酶的定量检测。
[0007]构建一种基于室温原位形成的荧光共聚物所搭建起来的检测辣根过氧化物酶的传感平台时，所述Tris
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HCl缓冲溶液的pH为7.4，Tris
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HCl的浓度为10mM，聚乙烯亚胺，对苯二胺和双氧水的浓度分别为5mg/mL，60μM和500μM。
[0008]取500μL Tris
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HCl缓冲溶液，先将500μM的双氧水和不同浓度的辣根过氧化物酶于摇床上25℃孵化，结束后再分别从250mg/mL的聚乙烯亚胺和10mM的对苯二胺母液中吸取10μL和3μL到离心管中，震荡摇匀，反应数分钟后，通过荧光光谱仪测量绘制荧光强度图。
[0009]本专利技术的技术方案之二是，基于一种辣根过氧化物酶诱导原位形成荧光共聚物的免疫荧光传感器检测心肌钙蛋白I型的方法，在96孔板中，捕获抗体与抗原相结合，随后抗原与一抗相连接，一抗又与HRP标记的二抗相连构建一个三明治式夹心免疫，最后加上荧光底物，通过形成荧光共聚物的荧光强度的变化来实现对心肌钙蛋白I型的定量检测。
[0010]在构建基于辣根过氧化物酶触发的荧光免疫传感平台时，所述Tris
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HCl缓冲溶液的pH为7.4，Tris
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HCl的浓度为10mM，聚乙烯亚胺的浓度为5mg/mL，对苯二胺的浓度为60μM，双氧水浓度为500μM，辣根过氧化物酶与双氧水的孵化温度为25℃，牛血清蛋白的浓度为20mg/mL，捕获抗体的浓度为1μg/mL，一抗浓度为2μg/mL,HRP标记的二抗浓度为0.5μg/mL,。
[0011]首先，一系列的单克隆抗体被注入到96孔板中4板中孵化过夜。孵育后，用TBST冲洗5次，每孔加入200μM牛血清白蛋白，防止孔板表面出现非特异性结合位点。随后，37℃孵育1小时，用TBST去除牛血清白蛋白。然后将不同浓度的cTnI溶液100μL，37℃孵育1h，用TBST去除未结合的cTnI后，取抗山羊抗/Ab2移入孔板中37℃孵育1h。结束孵化后,TBST清洗五次，然后加入Tris
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HCl缓冲液，HRP标记的兔羊二抗和过氧化氢25℃孵化1h，从而构成三明治式夹心免疫。最后，使用TBST冲洗，并在孔板中加入对苯二胺和聚乙烯亚胺。在室温下反应数分钟后进行荧光光谱分析。
[0012]本专利技术的技术方案之三是，基于一种辣根过氧化物酶诱导原位形成荧光共聚物的免疫荧光传感器在血清中检测心肌钙蛋白I型的应用，在夹心免疫完成后，室温条件下，在Tris
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HCl缓冲溶液中加入一定量人体稀释血清，再加入一定量的聚乙烯亚胺和对苯二胺，反应数分钟后生成强绿色FCNPs，并且FCNPs的荧光强度随着心肌钙蛋白I型的增加而逐渐增加，进而实现在血清中进行心肌钙蛋白I型的定量检测。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种室温形成荧光共聚物检测辣根过氧化物酶的方法，其特征在于：室温条件下，在Tris
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HCl缓冲溶液中，先加入辣根过氧化物酶(HRP)和双氧水(H2O2)在摇床上孵化，随后加入聚乙烯亚胺(PEI)和对苯二胺，混合均匀，生成的强绿色的荧光共聚物(FCNPs)，通过荧光光谱仪对合成的FCNPs进行荧光强度检测。2.根据权利要求1所述的室温形成荧光共聚物检测辣根过氧化物酶的方法，其特征在于：FCNPs合成条件为：Tris
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HCl缓冲溶液的pH为7.4，Tris
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HCl的浓度为10mM，辣根过氧化物酶的浓度为120mU/mL，双氧水的浓度为500μM，对苯二胺的浓度为60μM，聚乙烯亚胺的浓度为5mg/mL，形成强绿色FCNPs，通过荧光光谱仪对合成的FCNPs进行荧光强度检测。3.根据权利要求2所述的室温形成荧光共聚物检测辣根过氧化物酶的方法，其特征在于：室温条件下，在Tris
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HCl缓冲溶液中，聚乙烯亚胺和对苯二胺在辣根过氧化物酶和双氧水共同存在下生成强绿色FCNPs，通过这种荧光强度的变化来实现对辣根过氧化物酶的检测。4.一种基于室温形成荧光共聚物为底物所构建的酶联免疫传感器来检测心肌钙蛋白I型的方法，其特征在于：首先，一系列的单克隆抗体被注入到96孔板中4℃孵化过夜；孵育后，用TBST冲洗5次，每孔加入200μM牛血清白蛋白，防止孔板表面出现非特异性结合位点；随后，37℃孵育1小时，用TBST去除牛血清白蛋白；然后将不同浓度的cTnI溶液100μL，37℃孵育1h，用TBST去除未结合的cTnI后，取抗山羊抗/Ab2移入孔板中37℃孵育1h。结束孵化后,TBST清洗五次，然后加入Tris
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HCl缓冲液，HRP标记的兔羊二抗和过氧化氢25℃孵化1h，从而构成三明治式夹心免疫；最后，使用TBST冲洗，并在孔板中加入对苯二胺和聚乙烯亚胺；在室温下反应数分钟后进行荧光光谱分析。5.根据权利要求4所述的基于室温形成荧光共聚物为底物而构建的免疫传感器来检测心肌钙蛋白I型的方法，其特征在于：该传感平台条件为：Tris
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HCl缓冲溶液的pH为7.4，Tris
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HCl的浓度为10mM，聚乙烯亚胺的浓度为5mg/mL，对苯二胺的浓度为60μM，双氧水浓度为500...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘金华，阮国通，张承武，李林，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：