本发明专利技术涉及生物技术领域，特别是涉及一种小分子药物制备成骨微环境的方法及其应用。本发明专利技术通过小分子药物处理细胞24小时后，然后撤药，利用持续激活的Wnt信号构建骨细胞Wnt成骨微环境并促进ST2细胞成骨分化，这种方式可以保证细胞信号通路不被长期激活或者过度激活，以及减少药物对其它组织细胞产生的失控作用或者副作用。该方法可以进一步结合硬材料与细胞一体化3D打印新技术制备具有成骨微环境的骨修复功能模块，在硬材料表面实现高存活率和增殖活性，增强材料的生物学活性。特别是模块中不含药物，使其可以安全地用于骨组织工程。此外，还可以通过合成靶向药物设计连接靶向骨的小分子基团，应用于骨松病人、促进老年人骨折愈合以及治疗骨不连等。折愈合以及治疗骨不连等。折愈合以及治疗骨不连等。
【技术实现步骤摘要】
一种小分子药制备成骨微环境的方法及其应用
[0001]本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种小分子药制备成骨微环境的方法及其应用。
技术介绍
[0002]骨缺损的来源有多种，包括感染、肿瘤切除、复杂创伤、翻修手术等。仅美国每年需要超过160万例骨移植，这给社会造成了巨大的经济负担。然而，目前的产品仍然面临着两个挑战：解剖特征不匹配和缺乏生物活性，导致不稳定、松动和需要翻新，这是外科医生头疼的问题。尽管3D打印技术可以通过按需打印所需的骨材料的结构和形状，消除了传统骨移植的不足，为功能性骨移植的发展创造了机会。但它们在促进骨骼组织再生时，也有相应的副作用，例如，在BMP的情况下，异位骨化、骨溶解和肿胀。目前，生物活性低仍然是一个需要克服的瓶颈。为了进一步提高骨移植的生物活性，以骨形态发生蛋白(BMP)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)等为主要生长因子的生物成分已成功地与各种生物材料结合制成骨植入物。
[0003]细胞微环境的生物学功能在维持骨骼组织的生理稳态以及骨修复和再生方面起着至关重要的作用。参与骨再生的细胞主要有三种：维持结构平衡的成骨细胞和破骨细胞，以及对环境、机械或化学信号刺激作出反应的骨细胞。近年来，研究人员对骨细胞的功能有了更全面的了解：除了作为机械传感细胞，向成骨细胞、破骨细胞等其他受体细胞发送信号外，它们还作为重要的内分泌细胞，分泌许多对成骨细胞和破骨细胞有很强作用的生物因子，控制骨微环境。例如，骨细胞分泌硬化素，一种有效的Wnt信号抑制剂，负向调节成骨细胞的分化和存活。
[0004]Wnt信号通过经典/非经典途径调控发育和出生后的过程，包括细胞增殖、分化、极化和迁移。β
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catenin是经典途径中的中枢转导因子，其配体与其受体Frizzled5/6及相关受体低密度脂蛋白(LRP5/6)结合，稳定胞浆内的β
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catenin。然后稳定的β
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catenin进入细胞核，与Wnt信号因子Tcf/Lef家族成员相互作用，激活Wnt靶基因的转录。我们发现，骨细胞中Wnt信号的激活介导了骨形成和骨吸收，这是骨合成代谢的一种生理功能。我们不仅在体内的基因操作研究中发现了骨细胞的这种功能，而且在Wnt激活的分离的原代骨细胞的体外研究中也发现了这种功能，尽管基于基因操作表达Wnt信号可以产生以上多种生物学功能，但无法转化应用。
[0005]因此如何在体外制备成骨微环境是目前亟待解决的问题。
技术实现思路
[0006]本专利技术的目的在于提供一种小分子药制备成骨微环境的方法，在体外制备成骨微环境具有促进成骨分化作用的同时还能保证其生物活性，能够应用于骨移植中，提高骨修复再生效率的同时减少它们在促进骨骼组织再生时带来的副作用。
[0007]为达到上述目的，本专利技术采用的具体技术方案如下：
[0008]本专利技术提供了一种小分子药制备成骨微环境的方法，所述方法包括：
[0009]步骤一：细胞的复苏与培养；
[0010]步骤二：细胞的传代；
[0011]步骤三：小分子药短时间范围激活细胞Wnt信号；
[0012]步骤四：获得成骨微环境；
[0013]所述营造成骨微环境的细胞包括骨髓基质细胞、骨祖细胞、前成骨细胞、成骨细胞、骨衬细胞、骨细胞或破骨细胞中至少一种细胞或两种以上细胞组合；
[0014]通过持续激活的Wnt信号制备成骨微环境并促进细胞成骨分化，保证细胞信号通路不被长期激活或者过度激活。
[0015]进一步地，所述细胞的复苏与培养包括以下步骤：
[0016](1)将含10％胎牛血清、50U/mL青霉素、50μg/mL链霉素的90％α
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MEM培养基、胰酶、无菌PBS提前30min放室温备用；
[0017](2)从
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80℃中取出骨细胞，立即放入37℃水浴中，快速摇晃1min，令其尽快融化；
[0018](3)从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液至培养皿，加入10ml完全培养基培养，轻轻摇晃均匀放回37℃培养箱；
[0019](4)12小时后吸弃培养液，再加入6ml新鲜完全培养基，放入37℃继续培养，此后两天半量更换新鲜培养基，每次换液时残余之前的培液3ml，加入新鲜培液3ml，根据细胞生长的状态，一般4
‑
5天左右待细胞长到融合度80％
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90％时进行传代。
[0020]通过以上步骤，使细胞从休眠状态恢复活性，并迅速生长，细胞状态较好便于细胞传代。
[0021]进一步地，所述细胞的传代包括以下步骤：
[0022](1)取需要传代的细胞，吸弃培养液，每个培养皿加入2ml无菌PBS，轻轻摇晃后吸弃，加入1ml预热的胰酶，放入37℃培养箱中消化1
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2min，显微镜下观察贴壁细胞呈圆形浮起即可加入1ml完全培养基终止消化；
[0023](2)用5ml移液管轻轻吹打细胞使其脱落，并将细胞收集移至15ml离心管中，1000rpm离心5min；
[0024](3)弃上清，在离心管中加入1ml完全培养基，重悬细胞，计数，以1.5
×
105cells/mL的密度接种于6孔板，每孔中加入1ml完全培养基，过夜生长12小时待细胞贴壁，生长稳定。
[0025]进一步地，小分子药激活骨细胞Wnt信号包括：
[0026]取出细胞，加入小分子药激活Wnt信号，作用24小时；
[0027]所述小分子药包括了所有能够激活Wnt信号的药物。
[0028]进一步地，所述制备成骨微环境的方法，所述小分子药为SKL2001，浓度为5
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100μM；
[0029]优选地，所述浓度为60μM。
[0030]进一步地，所述获得成骨微环境包括以下步骤：
[0031](1)Wnt信号激活剂作用细胞24小时，吸弃含SKL2001的培养基；
[0032](2)加入无菌PBS清洗细胞2
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3次后加入不含Wnt信号激活剂的完全培养基；
[0033](3)将细胞按照上述传代方法消化。
[0034]本专利技术提供一种成骨微环境，所述成骨微环境通过上述方法制备获得。
[0035]本专利技术还提供了一种成骨微环境在新骨形成中的应用，所述成骨微环境，能够促进成骨分化，形成新骨，可用于骨缺损、骨质疏松性、骨折。
[0036]一种利用成骨微环境制备骨功能模块的方法，包括高强度生物医用材料与成骨微环境制备骨功能模块的方法；
[0037]所述高强度生物医用材料是指压缩强度在2MPa及以上的硬材料；
[0038]所述高强度生物医用材料以硬材料束的形式进行打印，所述成骨微环境以细胞束的形式进行打印；
[0039]所述方法还包括，利用多喷头交替打印硬材料束和细胞束，使硬材料束和细胞束平行排列成层，再逐层打印成具有孔道的立体结构，层间硬材本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种小分子药制备成骨微环境的方法，其特征在于：所述方法包括：步骤一：细胞的复苏与培养；步骤二：细胞的传代；步骤三：小分子药短时间范围激活细胞Wnt信号；步骤四：获得成骨微环境；所述细胞为骨细胞，包括骨细胞系，原代骨细胞至少一种细胞或两种以上骨细胞组合；所述成骨微环境为经过上述步骤制备的细胞；通过持续激活的Wnt信号的骨细胞及其培养上清，或者分泌的囊泡或外泌体，或者脱细胞基质，或者两种或者两种以上的组合，制备成骨微环境并促进细胞成骨分化、矿化，形成骨。而且Wnt信号通路不被长期激活。2.根据权利要求1所述制备成骨微环境的方法，其特征在于：所述细胞的复苏与培养包括以下步骤：(1)将含10％胎牛血清、50U/mL青霉素、50μg/mL链霉素的90％α
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MEM培养基、胰酶、无菌PBS提前30min放室温备用；(2)从
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80℃中取出骨细胞，立即放入37℃水浴中，快速摇晃1min，令其尽快融化；(3)从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液至培养皿，加入10ml完全培养基培养，轻轻摇晃均匀放回37℃培养箱；(4)12小时后吸弃培养液，再加入6ml新鲜完全培养基，放入37℃继续培养，此后两天半量更换新鲜培养基，每次换液时残余之前的培液3ml，加入新鲜培液3ml，根据细胞生长的状态，一般4
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5天左右待细胞长到融合度80％
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90％时进行传代。3.根据权利要求2所述制备成骨微环境的方法，其特征在于：所述细胞的传代包括以下步骤：(1)取需要传代的细胞，吸弃培养液，每个培养皿加入2ml无菌PBS，轻轻摇晃后吸弃，加入1ml预热的胰酶，放入37℃培养箱中消化1
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2min，显微镜下观察贴壁细胞呈圆形浮起即可加入1ml完全培养基终止消化；(2)用5ml移液管轻轻吹打细胞使其脱落，并将细胞收集移至15ml离心管中，1000rpm离心5min；(3)弃上清，在离心管中加入1ml完全培养基，重悬细胞，计数，以1.5
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105cells/mL的密度接种于6孔板，每孔中加入1ml完全培养基，过夜生长12小时待细胞贴壁，生长稳定。4.根据权利要求3所述制备成骨微环境的方法，其特征在于：小分子药物激活细胞Wnt信号包括...
【专利技术属性】
技术研发人员：涂小林，刘洋汐，李军，王波，阮晓颉，陈杰，王晓芳，王彭涛，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：
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