一种用于血清中45种炎症及免疫代谢物相对定量的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用液相色谱质谱联用技术相对定量血清45种炎症及免疫代谢物的检测方法，属于生物分析检测技术领域。本发明专利技术通过除蛋白、衍生化等步骤对血清样本进行预处理，并利用液相色谱质谱联用技术对包括45种炎症及免疫相关代谢物进行相对定量，该方法具有快速、简便、可靠的优点。可靠的优点。可靠的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种用于血清中45种炎症及免疫代谢物相对定量的方法


[0001]本专利技术涉及分析化学和临床检验应用领域，是一种用于相对定量炎症及免疫状态的代谢物的检测方法。
技术背景
[0002]随着新冠肺炎的爆发，细菌或病毒感染而导致的炎症和免疫反应越来约得到临床重视，这些病原微生物导致的炎症因子风暴及免疫反应可对机体造成严重的器质性损伤甚至死亡，且其发生快速而不可预料。可见，这些炎症及免疫反应不仅严重威胁着人们的健康，而且给医护系统带来沉重的负担及困扰。因此，如何快速地对各种病原微生物导致的异常炎症及免疫状态进行表征具有重要的临床意义及社会价值。
[0003]代谢组作为中心法则的终端表现，能够直接地反映出细胞功能状态的变化，是炎症免疫反应作用下机体状态最直观的体现。近年来，代谢产物作为生物标志物被广泛地用于疾病的诊断和预测，而炎症及免疫状态所导致的代谢轮廓异常也被大量证实。然而，由于炎症及免疫代谢物的种类、含量及性质差别较大，较难在一次快速分析中进行全面定量分析。目前仍然没有专门用于炎症及免疫状态表征的代谢物检测方法的报道。液相色谱质谱联用技术已经被证实在小分子代谢物检测中具有灵敏度高、分析通量大、特异性好等优点，适用于小分子代谢物的快速、高通量检测。
[0004]炎症和免疫代谢物种类繁多且化学性质差异较大，既包括氨基酸等极性较大的化合物，也包括脂肪酸、磷脂酰胆碱等极性较小的化合物，这使得这些化合物较难在一次色谱分离中快速分析。丹磺酰化通过在含氨基代谢物的氨基位点引入含有季氮的磺酰基来增强含氮化合物的色谱保留，同时还可以较为显著地增加其离子化效率，从而使极性差异较大的炎症及免疫代谢物能够在一次分析中得到快速分离。本专利技术针对45种炎症及免疫代谢物，通过对包括衍生化条件在内的前处理方法及液相色谱质谱分析方法的优化可以在一次样本分析中对其进行相对定量，本专利技术经过分析特性评估，具有较低的检测限、较宽的线性范围、较好的精密度和稳定性。目前尚无针对这45个炎症及免疫代谢物进行快速相对定量分析方法的报道。

技术实现思路
：
[0005]本专利技术的目的是针对临床上尚无专门用于炎症及免疫代谢物相对定量方法的实际问题，提供了一种基于液相色谱质谱联用技术的炎症及免疫代谢物相对定量方法。
[0006]该检测方法针对45种炎症及免疫代谢物，其名字、保留时间及检测离子对(括号中)分别为：犬尿酸(1.40
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2.75min、m/z 190.00>144.00)、鸟氨酸(3.50
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4.10min、m/z 300.00>157.00)、3
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羟基犬尿酸胺(3.50
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4.60min、m/z 309.00>157.00)、胍基乙酸(2.40
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4.00min、m/z 351.00>170.00)、皮质醇(2.60
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3.17min、m/z 363.00>121.00)、肌酸(2.40
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3.00min、m/z 365.00>170.00)、胍基丁胺(2.75
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3.40min、m/z 364.00>170.00)、天冬氨酸(2.60
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2.90min、m/z 367.00>170.00)、石胆酸(3.40
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4.10min、m/z 377.30>57.00)、3
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羟基
邻氨基苯甲酸(4.10
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5.10min、m/z 387.00>170.00)、精氨酸(2.30
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2.64min、m/z 408.00>170.00)、瓜氨酸(2.44
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2.84min、m/z 409.00>170.00)、色氨酸(3.10
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3.66min、m/z 438.00>170.00)、犬尿氨酸(3.10
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3.76min、m/z 442.00>170.00)、甘鹅去氧胆酸(3.20
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3.77min、m/z 450.30>432.10)、甘胆酸(3.50
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4.00min、m/z 466.30>449.10)、9
‑
羟基十八碳二烯酸(3.80
‑
4.80min、m/z 295.00>171.00)、13
‑
羟基十八碳二烯酸(3.80
‑
4.80min、m/z 295.00>195.00)、二十碳五烯酸(4.90
‑
5.80min、m/z 301.00>257.00)、花生四烯酸(5.30
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5.80min、m/z 303.00>259.00)、9,10
‑
二羟基十八烯酸(3.50
‑
4.42min、m/z 313.00>201.00)、5
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羟基硅藻酸四烯酸(4.00
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5.20min、m/z 319.00>115.00)、8
‑
羟基硅藻酸四烯酸(4.00
‑
5.20min、m/z 319.00>155.00)、11
‑
羟基硅藻酸四烯酸(4.00
‑
5.20min、m/z 319.00>167.00)、二十二碳六烯酸(5.10
‑
6.10min、m/z 327.00>283.00)、8
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羟基二十二碳六烯酸(4.30
‑
5.05min、m/z 343.00>281.00)、邻花生四烯醇酰乙醇胺(4.70
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5.30min、m/z 348.00>62.00)、前列腺素E2(2.90
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3.60min、m/z 351.00>175.30)、前列腺素D2(2.90
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3.60min、m/z 351.00>203.00)、脱氢表雄酮(2.70
‑
3.39min、m/z 367.00>96.80)、脱氧胆酸(3.00
‑
5.00min、m/z 391.30>371.30)、熊去氧胆酸(3.73
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4.17min、m/z 391.30>373.30)、鹅去氧胆酸(3.80
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4.60min、m/z 391.30>373.30)、胆酸(3.00
‑
3.74min、m/z 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于血清中45种炎症及免疫代谢物相对定量的方法，其特征在于：针对血清中45种炎症及免疫相关代谢物，首先利用含内标的试剂对血清样本进行预处理从而得到分析样本，分析样本进一步利用液相色谱质谱联用技术对样本进行分析，得到的色谱峰面积数据利用内标化合物进行标准化(待测物浓度＝内标浓度*待测物峰面积/内标峰面积)得到相对含量。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述45种炎症及免疫代谢物包括：犬尿酸、鸟氨酸、3
‑
羟基犬尿酸胺、胍基乙酸、皮质醇、肌酸、胍基丁胺、天冬氨酸、石胆酸、3
‑
羟基邻氨基苯甲酸、精氨酸、瓜氨酸、色氨酸、犬尿氨酸、甘鹅去氧胆酸、甘胆酸、9
‑
羟基十八碳二烯酸、13
‑
羟基十八碳二烯酸、二十碳五烯酸、花生四烯酸、9,10
‑
二羟基十八烯酸、5
‑
羟基硅藻酸四烯酸、8
‑
羟基硅藻酸四烯酸、11
‑
羟基硅藻酸四烯酸、二十二碳六烯酸、8
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羟基二十二碳六烯酸、邻花生四烯醇酰乙醇胺、前列腺素E2、前列腺素D2、脱氢表雄酮、脱氧胆酸、熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸、胆酸、单酰磷脂酰胆碱14:0、单酰磷脂酰胆碱16:0、单酰磷脂酰胆碱17:0、单酰磷脂酰胆碱18:2、单酰磷脂酰胆碱18:1、单酰磷脂酰胆碱18:0、单酰磷脂酰胆碱20:4、单酰磷脂酰胆碱22:6、单酰磷脂酰胆碱22:5、磷脂酰胆碱16:0/16:0、磷脂酰胆碱18:0/18:0。3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，样本预处理方法为：于10～12μL人的血清中加入40uL～48μL含有内标的5～10mg/mL丹磺酰氯乙腈溶液，涡旋1～2分钟后，加入40～48μL碳酸钠/碳酸氢钠(0.4～0.6M,pH＝9.0～9.2)缓冲溶液并涡旋1～2分钟，55～60℃反应4～6分钟，再加入20～30μL丁胺水溶液(0.4～0.6M)55～60℃反应2～3min，反应后15000～18000g离心10～15min，取上清液50～70μL待进样分析；内标化合物及其在乙腈中的浓度为棕榈酸
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d3(5～10μg/mL)、鹅去氧胆酸
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d4(5～10μg/mL)、胆酸
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d4(5～10μg/mL)、色氨酸
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d5(5～10μg/mL)以及亮氨酸
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d3(5～10μg/mL)。4.根据权利1所述方法，其特征在于：液相色谱条件为：水相为含有5mM乙酸铵的去离子水，有机相为含有5mM乙酸铵的90％乙腈水，色谱柱为Water BEH C8(2.1mm
×
50mm,1.7μm)，柱温为50℃，色谱梯度为：初始梯度为5％有机相，维持0.5分钟5％有机相，有机相从0.5分钟到7分钟线性升到100％，从7分钟到10分钟维持100％有机相，到10.1分钟将有机相降至5％，平衡该梯度至12分钟，流速为0.4mL/min；质谱条件为：质谱类型为三重四级杆或四级杆
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离子阱串联质谱，离子源为可正负离子模式切换的电喷雾离子源，喷雾电压正离子为3～3.2kV，负离子为2.5～2.8kV；脱溶剂气流量为650～800L/h，温度为330～350℃；扫描模式为多反应监测；氩气为碰撞气；45种代谢物保留时间段、多反应监测离子对及优化碰撞能为：犬尿酸(1.40
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2.75min、m/z 190.00>144.00、20V)、鸟氨酸(3.50
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4.10min、m/z 300.00>157.00、20V)、3
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羟基犬尿酸胺(3.50
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4.60min、m/z 309.00>157.00、25V)、胍基乙酸(2.40
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4.00min、m/z 351.00>170.00、20V)、皮质醇(2.60
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3.17min、m/z 363.00>121.00、20V)、肌酸(2.40
‑
3.00min、m/z 365.00>170.00、20V)、胍基丁胺(2.75
‑
3.40min、m/z 364.00>170.00、20V)、天冬氨酸(2.60
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2.90min、m/z 367.00>170.00、20V)、石胆酸(3.40
‑
4.10min、m/z 377.30>57.00、40V)、3
‑
羟基邻氨基苯甲酸(4.10
‑
5.10min、m/z 387.00>170.00、20V)、精氨酸(2.30
‑
2.64min、m/z 408.00>170.00、25V)、瓜氨酸(2.44
‑
2.84min、m/z 409.00>170.00、25V)、色氨酸(3.10
‑
3.66min、m/z 438.00>170.00、20V)、犬尿氨酸(3.10
‑
3.76min、m/z442.00>
170.00、20V)、甘鹅去氧胆酸(3.20
‑
3.77min、m/z 450.30>432.10、20V)、甘胆酸(3.50
‑
4.00min、m/z 466.30>449.10、20V)、9
‑
羟基十八碳二烯酸(3.80
‑
4.80min、m/z 295.00>171.00、18V)、13
...

【专利技术属性】
技术研发人员：许国旺，陆欣，窦鹏，谢小玉，王晓琳，刘心昱，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：