一种抗裂谷热病毒的单克隆抗体A38及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抗裂谷热病毒的单克隆抗体，所述抗体通过流式分选

【技术实现步骤摘要】
一种抗裂谷热病毒的单克隆抗体A38及应用


[0001]本专利技术公开了一种抗体，属于微生物学和免疫学领域。

技术介绍

[0002]裂谷热是由裂谷热病毒引起的一种人兽共患蚊媒传染病，因最早分离自东非大裂谷而得名。主要在非洲区域流行，亚洲地区有输入性病例报告。2016年，我国发现了首例输入性裂谷热病例。裂谷热跨区域传播的潜在风险，也对我国的生物安全提出了挑战。WHO分别于2015年、2016年和2018年发布当前最需研究的病毒清单，裂谷热病毒位列其中。1997年7月，生物武器缔约国政府专家特设小组第7次会议将裂谷热与埃博拉、马尔堡等一起列入攻击人的病毒类战剂。裂谷热临床症状为发热、头痛和肌肉关节痛，重症病例可表现为多脏器受累，病死率高。2020年9月毛里塔尼亚暴发裂谷热疫情，报告确诊病例75例，死亡25例，病死率33.3%。裂谷热的治疗以对症支持治疗为主，目前没有有效的治疗手段。相较于其他类型药物，单克隆抗体药物具有靶标明确，作用特异，起效迅速，副作用较小等优点，因而单抗成为抗病毒领域的研究热点。研制特异性单抗治疗药物对于裂谷热病毒相关的疫情防控、防生、反生物恐怖均具有重要意义。
[0003]截止2021年2月，FDA许可的100种抗体新药中有6个抗感染单抗新药，可以说抗感染单抗占有一席之地，其中包括针对炭疽的单抗2个，针对埃博拉的单抗2个。 随着抗体研发技术的不断进步和全球对突发公共卫生事件关注，获批抗感染抗体新药加速增加。新冠大流行更是将抗感染抗体新药研发推向新的高度，特别是变异株的不断出现，吸引越来越多的关注。美国再生元和VIR公司在抗埃博拉和SARS
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COV
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2病毒抗体研发上均有抗埃博拉单抗获批上市，新冠单抗获EUA许可。我国目前没有抗感染单抗获批上市。
[0004]目前，国内外无裂谷热疫苗和中和单抗获批上市。美国陆军传染病研究所研制的减毒疫苗MP
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12完成II期临床。裂谷热中和单抗研发处于实验室研究阶段，且主要针对于裂谷热病毒表面糖蛋白（Gn和Gc蛋白）进行研发。其中，Gn蛋白主要介导病毒的识别宿主细胞的受体，Gc蛋白主要介导病毒与宿主细胞的膜融合。2018年英国牛津大学Thomas A. Bowden等用流式分选获得靶向Gn蛋白具有中和活性的兔单克隆抗体，并在小鼠模型上验证了单抗的保护活性。德国科学家2020年报道筛选获得2株靶向Gn蛋白的鼠单抗Gn3和Gn32，如果使用Gn3单抗进行小鼠体内保护实验，保护率58%，使用Gn3和Gn32的“鸡尾酒”疗法获得完全保护，提示联用具有更好的治疗前景。高福、严景华团队在一例RVFV感染的康复病人体内率先分离到高效中和RVFV感染的单克隆抗体。该抗体在小鼠模型上能有效治疗RVFV感染，有望成为治疗其感染的候选药物。
[0005]本专利技术的目的就是提供一种对裂谷热病毒具有高中和活性的单克隆抗体，并进一步提供其在制备裂谷热治疗药物中的应用。

技术实现思路

[0006]基于上述专利技术目的，本专利技术首先构建了基于腺病毒载体的裂谷热候选疫苗，通过
免疫恒河猴，流式分选
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单细胞PCR技术筛选到了一种抗裂谷热病毒的单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第27
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35、53
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60、99
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112位氨基酸序列所示；轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5第26
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34、52
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58、97
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106位氨基酸序列所示。
[0007]在一个优选的技术方案中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序如SEQ ID NO:1所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。在本专利技术中，具有所述重链和轻链可变区的一个具体的抗体被命名为“A38”。
[0008]在一个更为优选的技术方案中，所述抗体的重链恒定区的氨基酸序如SEQ ID NO:3所示，所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9所示，其中，SEQ ID NO:7为κ链恒定区的序列，SEQ ID NO:9为λ链恒定区的序列，所述抗体的重链恒定区和轻链恒定区为人源。
[0009]第二，本专利技术还提供了一种编码上述单克隆抗体重链和轻链的碱基编码序列，所述抗体的重链可变区的碱基编码序列由SEQ ID NO:2所示，所述抗体的轻链可变区的碱基编码序列由SEQ ID NO:6所示。
[0010]在一个优选的技术方案中，所述抗体的重链恒定区的碱基编码序列由SEQ ID NO:4所示，所述抗体的轻链恒定区的碱基编码序列由SEQ ID NO:8或者SEQ ID NO:10所示。
[0011]第三，本专利技术还提供了一种表达上述编码单克隆抗体重链和轻链的核苷酸编码序列的功能元件，这种功能元件可以是传统的表达载体。
[0012]在一个优选的技术方案中，所述功能元件为线性表达框。
[0013]第四，本专利技术还提供了一种含有上述线性表达框的宿主细胞。
[0014]在一个优选的技术方案中，所述细胞为Expi 293F细胞。
[0015]在另一个优选的技术方案中，所述细胞为CHO细胞。
[0016]最后，本专利技术还提供了上述单克隆抗体在制备裂谷热治疗药物中的应用。
[0017]本专利技术提供的单克隆抗体显示出对裂谷热病毒感染细胞良好的中和保护效果。本专利技术的结果显示，所述抗体在制备裂谷热治疗药物中具有广泛应用的前景。本专利技术公开的单克隆抗体还具有以下的技术优势:（1）高结合活性，重组单抗与Gn蛋白KD 小于1nM；（2）高中和活性 在细胞模型上IC
50
小于1nM；在致死小鼠模型上，20 ug/只就可提供完全保护。（3）稳定性好 因为抗体基因来自恒河猴的同一个细胞，是天然配对的。
附图说明
[0018]图1. 免疫后不同时间点恒河猴体内针对Gn和Gc蛋白IgG抗体效价曲线图；图2. Gn和Gc蛋白特异的记忆B细胞的分选策略图；图3. 重链二轮巢式PCR扩增产物核酸电泳检测图；图4. 轻链二轮巢式PCR扩增产物核酸电泳检测图；图5. 重链和轻链可变区扩增产物核酸电泳检测图；图6. 前导序列和恒定区
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多聚A尾的扩增电泳检测图；图7. 重链和轻链线性表达框的核酸电泳检测图；图8. 线性表达框转染表达抗体结合活性检测图；图9. 重链和轻链全长扩增产物核酸电泳检测图；
图10. 表达载体pCNDA3.4双酶切线性化核酸电泳检测图；图11. 表达载体的双酶切鉴定核酸电泳检测图；图12. 亲和层析纯化后的单抗SDS
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PAGE检测图；图13. 单抗与Gn蛋白的结合活性检测图；图14. 单抗与Gn蛋白的亲和力检测图；图15. 单抗在细胞模型上的IC50测定图；图16. 单抗对感染RVFV小鼠的保护效果统计图；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗裂谷热病毒的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第27
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35、53
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60、99
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112位氨基酸序列所示；轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5第26
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34、52
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58、97
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106位氨基酸序列所示。2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 5所示。3.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于，所述抗体重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9所示。4.一种编码权利要求1
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3任一所述单克隆抗体重链和轻链的多核苷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈薇，李建民，郝勐，于长明，侯利华，卞婷，陈旖，房婷，刘树玲，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：