一种用于检测烟草普通花叶病毒的实时荧光定量PCR方法技术

本发明专利技术涉及花叶病毒实时检测领域，具体涉及一种用于检测烟草普通花叶病毒的实时荧光定量PCR方法，包括以下步骤：步骤一：TMV引物及探针的设计与合成；步骤二：总RNA的提取与RT

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测烟草普通花叶病毒的实时荧光定量PCR方法


[0001]本专利技术涉及花叶病毒实时检测领域，具体涉及一种用于检测烟草普通花叶病毒的实时荧光定量PCR方法。

技术介绍

[0002]烟草普通花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）为RNA病毒，是烟草花叶病等的病原体，属于Tobamovirus群，是烟草生产上分布最广、 发生最为普遍的一类病害，对烟草的危害极大，导致叶上出现花叶症状，生长陷于不良状态，叶常呈畸形，从而直接影响烟叶的产量、质量和种植效益，发生严重时，损失可达30%—50%，甚至可能造成烟田绝收。TMV主要通过机械摩擦传播，幼苗期或大田期均可感染，且苗期带毒是大田烟草普通花叶病毒病的一个主要初侵染源。
[0003]因而对烟草漂浮育苗过程中的烟苗进行快速、准确检测是控制TMV流行的重要保证，目前应用于植物病毒病检测的方法主要有血清学检测、生物学检测和分子生物学检测等，如核酸分子杂交技术、反转录聚合酶链式反应技术和实时荧光定量技术等。与实时荧光定量PCR技术相比，其他方法都存在耗时长、灵敏度低和不能对病本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测烟草普通花叶病毒的实时荧光定量PCR方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一：TMV引物及探针的设计与合成，根据NCBI数据库中TMV的外壳蛋白基因保守序列:AJ239099.1和内参基因HSC70
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1：DV161835，根据TMV引物和TaqMan探针设计原则，利用Primer Premier 5.0软件设计荧光定量PCR检测的引物及探针，并通过NCBI中的Primer
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BLAST进行比对，保证所设计引物的特异性；其中，上游的引物TMV
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F： GTTAGGTTCCCTGACAGTGACTTT，下游引物TMV
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R：GTTCGCCTGATTTTCAACTTCT，探针：FAM
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TACAGGTACAATGCGGT
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MGB，所述的AJ239099.1的序列表为SEQ ID No.1 所示，DV161835的序列表为SEQ ID No.2所示；步骤二：总RNA的提取与RT
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PCR，采用Trizol法提取植物总RNA，用Eppendorf D30紫外分光光度计测定所得RNA的浓度，1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性；进行cDNA第一链的合成反应体系并进行PCR反应体系；步骤三：目的基因鉴定，将步骤二中PCR反应体系产生的常务进行琼脂糖凝胶电泳后，切下目的条带，胶回收试剂盒纯化回收后，连接至pMD
™
18
‑
T Vector，并转化进入感受态细胞Trans 5α，37℃过夜培养后经蓝白斑筛选，分别挑选白色单菌落和蓝色单菌落置于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中分开震荡培养，使用天根质粒提取试剂盒完成质粒的提取，提取的质粒用pMD
™
18
‑
T Vector通用引物BcaBEST Sequencing Primers、M13 Primers进行PCR鉴定，且进行PCR反应体系，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，对符合预期大小目的条带的质粒样品送进测序，余下的质粒样品保存于
‑
20℃内；步骤四：质粒标准品的制备，质粒样品经测序鉴定无误后，用分光光度计测定质粒OD260的值，通过公式：C=A/B
×
6.02
×
10
14
，计算出质粒浓度拷贝数，将其作为质粒标准品使用；步骤五：标准曲线的建立，将质粒标准品用EASY Dilution进行10倍梯度稀释，分别获得TMV终浓度为4.53
×
101—4.53
×
109copies/
µ
l的9个质粒样品、内参基因终浓度为5.03
×
101—5.03
×
109copies/
µ
l的9个质粒样品，以稀释后的质粒样品作为模板，利用ABI 7500 fast实时荧光定量PCR仪进行实时荧光定量（RT
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qPCR）反应体系，每个浓度进行三次技术重复，通过仪器生成标准曲线。2.根据权利要求1所述的一种用于检测烟草普通花叶病毒的实时荧光定量PCR方法，其特征在于：所述的步骤二中采用Trizol法提...

【专利技术属性】
技术研发人员：白静科，吴彦辉，邱睿，宋鹏宇，王遂法，周密，郝浩浩，金磊，董宁禹，王俊，陈玉国，刘翔文，牛莉莉，李静静，
申请(专利权)人：河南省农业科学院烟草研究所，
类型：发明
国别省市：