猫传染性腹膜炎病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及猫传染性腹膜炎病毒荧光定量RT

【技术实现步骤摘要】
猫传染性腹膜炎病毒荧光定量RT
‑
PCR检测试剂盒


[0001]本专利技术涉及生物
中病毒分子生物学检测用试剂盒，具体涉及一种猫传染性腹膜炎病毒荧光定量RT
‑
PCR检测试剂盒。

技术介绍

[0002]猫传染性腹膜炎(Feline Infectious Peritonitis，FIP)是由猫传染性腹膜炎病毒(Feline Infectious Peritonitis Virus，FIPV)引起的猫临床常见的一种传染病，死亡率高，严重危害猫的健康。FIPV属于猫冠状病毒(Feline Coronavirus，FCoV)，是一种有包膜的单股正链RNA病毒。猫传染性腹膜炎病毒主要编码刺突蛋白、膜蛋白、包膜蛋白和核衣壳蛋白4种结构蛋白。研究表明，冠状病毒的核衣壳蛋白(Nucleocapsid Protein，N蛋白)作为免疫原性最强的蛋白，其对应的抗体是最早产生的，所以N蛋白常被用来作为早期诊断的指标。猫冠状病毒分为胃肠炎型(FECV)和传染性腹膜炎型(FIPV)两种，FECV存在于大多数健康猫肠道内，通常不致死，只引起猫轻微的肠道症状。FIPV主要感染单核细胞，具有很强的致病性，能引起猫的致死性腹膜炎。猫传染性腹膜炎的诊断分为临床诊断和实验室诊断。临床诊断依赖于临床症状的表现以及诊断者的经验，而患猫传染性腹膜炎的猫初期症状不明显，病程进展有较大差异，易导致诊断结果不准确，往往因误诊而贻误最佳治疗时机，最终导致病猫死亡。实验室诊断包括病理学检查、血清学检测和RT
‑
PCR检测等。RT
‑
PCR检测虽然成本低、易于操作，但灵敏度较低，FIPV感染的早期阶段，病毒在腹腔液中含量极少，RT
‑
PCR检测容易导致漏检，不能准确检测出FIPV。此外，由于其扩增产物需通过凝胶电泳分析，极易产生交叉污染，也比较容易出现假阳性结果，并且该实验时间也相对较长。实时荧光定量PCR技术由于其灵敏度高、速度快、特异性强且操作简便而被广泛应用于定性和定量检测等方面。实时荧光定量PCR技术是一种在PCR体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。目前较常用的实时荧光定量PCR为SYBR GreenⅠ荧光定量PCR和Taqman探针荧光定量PCR，SYBR GreenⅠ由于能够结合所有dsDNA双螺旋小沟区域，致使检测的特异性不如TaqMan水解探针法强。
[0003]目前国内尚未见用Taqman探针实时荧光定量RT
‑
PCR技术对猫传染性腹膜炎病毒进行定量检测试剂盒的报道。因此，为了进一步提高检测的灵敏度，实现临床样本中猫传染性腹膜炎病毒的定量检测，为猫传染性腹膜炎的早期诊断提供技术手段，也为猫传染性腹膜炎的防控和净化奠定基础，制造猫传染性腹膜炎病毒的Taqman探针实时荧光定量PCR检测试剂盒具有重要意义，市场前景广阔。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供了猫传染性腹膜炎病毒荧光定量RT
‑
PCR检测试剂盒。
[0005]猫传染性腹膜炎病毒荧光定量RT
‑
PCR检测试剂盒，该试剂盒包括猫传染性腹膜炎病毒N基因的保守区域片段纯化产品，所述的保守区域片段为ATGGCCACACAGGGACAACGCGTCAACTGGGGAGATGAACCTTCCAAAAGACGTGGTCGTTCTAACTCTCGTGGTCGGAAGAATAGTAATATACCT。
[0006]本专利技术的试剂盒包括猫传染性腹膜炎病毒荧光定量RT
‑
PCR检测的特异性引物和TaqMan探针；其中，正向引物的序列为：5
’‑
CACAGGGACAACGCGTCAA
‑3’
，反向引物的序列为：5
’‑
CGACCACGAGAGTTAGAACGA
‑3’
；所述TaqMan探针的序列为：5
’‑
TGGGGAGATGAACCTTCCAAAAGACGT
‑3’
。
[0007]本专利技术的试剂盒包括说明书，该说明书记载有以下内容：所述的荧光定量RT
‑
PCR反应体系总体积为20μL，包括：2 x RT
‑
PCR Buffer 10μL、25 x RT
‑
PCR Enzyme Mix 1μL、正向引物(10pmol/μL)0.4μL、反向引物(10pmol/μL)0.4μL、TaqMan探针(10μmol/μL)0.2μL、50 x Rox 0.4μL、模板1～5μL，用ddH20补充总体积至20μL。
[0008]本专利技术的试剂盒包括说明书，该说明书记载有以下内容：所述的荧光定量RT
‑
PCR反应条件如下：55℃，15min；95℃，30s；95℃，10s，60℃，30s，共45个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。
[0009]本专利技术所提供的特异性引物和TaqMan探针是根据猫传染性腹膜炎病毒N基因的保守区域设计的，用以定量检测样本中猫传染性腹膜炎病毒的核酸拷贝数。
[0010]所述TaqMan探针为经过荧光标记的，其5
’
端标记有报告荧光基团，3
’
端标记有淬灭荧光基团。
[0011]所述报告荧光基团为FAM，淬灭荧光基团为TAMRA。
[0012]使用本专利技术试剂盒还包括荧光定量PCR标准曲线的建立，方法为：用含有目的片段的重组质粒作为标准品，将其10倍系列稀释成
①
：3.4
×
108copies/μL；
②
：3.4
×
107copies/μL；
③
：3.4
×
106copies/μL；
④
：3.4
×
105copies/μL；
⑤
：3.4
×
104copies/μL；
⑥
：3.4
×
103copies/μL；
⑦
：3.4
×
102copies/μL；
⑧
：3.4
×
101copies/μL。将标准重组质粒作为模板进行实时荧光定量RT
‑
PCR检测，得到用于猫传染性腹膜炎病毒检测的荧光定量PCR标准曲线。
[0013]本专利技术的有益效果为：
[0014]1、本专利技术为国内首次建立的猫传染性腹膜炎病毒TaqMan探针荧光定量RT
‑
PCR检测试剂盒；通过特性试验表明：使用该试剂盒对猫传染性腹膜炎病毒进行检测，检测灵敏度高，最小核酸检出量为3.4x101copies/μL；使用该试剂盒对猫传染性腹膜炎病毒进行检测，具有较高的特异性，与狂犬病毒、猫疱疹病毒、杯状病毒、猫细小病毒、犬流感病毒本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.猫传染性腹膜炎病毒荧光定量RT
‑
PCR检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括猫传染性腹膜炎病毒N基因的保守区域片段纯化产品，所述的保守区域片段为ATGGCCACACAGGGACAACGCGTCAACTGGGGAGATGAACCTTCCAAAA GACGTGGTCGTTCTAACTCTCGTGGTCGGAAGAATAGTAATATACCT。2.猫传染性腹膜炎病毒荧光定量RT
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PCR检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括猫传染性腹膜炎病毒荧光定量RT
‑
PCR检测的特异性引物和TaqMan探针；其中，正向引物的序列为：5
’‑
CACAGGGACAACGCGTCAA
‑3’
，反向引物的序列为：5
’‑
CGACCACGAGAGTTAGAACGA
‑3’
；所述TaqMan探针的序列为：5
’‑
TG...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩佃刚，董俊，叶玲玲，艾军，杨妮，张冲，杨云庆，李静，李瑶瑶，罗倩敏，董仙兰，宿放，
申请(专利权)人：昆明海关技术中心，
类型：发明
国别省市：