具有自组装特性和生物矿化功能的藤壶胶蛋白20K衍生多肽、其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及具有自组装特性和生物矿化功能的藤壶胶蛋白20K衍生多肽、其制备方法和应用，通过同源序列比对获得了潜在功能片段cp20k

【技术实现步骤摘要】
具有自组装特性和生物矿化功能的藤壶胶蛋白20K衍生多肽、其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物医用材料
，具体涉及具有自组装特性和生物矿化功能的藤壶胶蛋白20K衍生多肽、其制备方法和应用，即具有自组装特性和生物矿化功能的cp20k
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p3及其突变体、其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]在骨科临床工作中经常见到由于创伤、感染、骨坏死及肿瘤等多种疾病引起的骨缺损和骨折不愈合，由此导致了临床中对骨修复材料的巨大需求。骨移植是临床上主要的治疗手段，其中自体骨移植效果最好，但其来源极少又会给患者产生新的创伤；异体骨移植易产生免疫排斥、感染和传播疾病的风险；普通的人工合成材料活性低且易产生异物排斥。理想的骨修复材料应该具备良好的生物相容性和可降解性，具有骨传导性和骨诱导性，具有良好的空隙率，低免疫原性，易塑形但有一定的机械强度等。因此非常有必要发掘新替代材料和方法解决以上问题。
[0003]骨组织工程学作为一种新的方法是将具有骨诱导活性的细胞因子，如骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)通过物理或化学方法引入到磷酸钙、聚乳酸等生物相容性好、可降解、具有一定力学强度的支架材料中，这种支架材料(复合材料)通过释放骨形态发生蛋白促进骨再生。当前国内诸多单位都采用了这种复合材料的方法，验证了生物支架结合生物因子的方法能够实现对骨损伤修复的促进作用。
[0004]目前，骨形态发生蛋白是唯一能够单独诱导异位成骨和单独促进骨缺损修复的生长因子，已确认的BMPs多达17种，主要分布于骨胶原纤维、骨膜、骨髓基质中，但含量非常少，且纯化困难，利用率很低。其中BMP
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2是诱导成骨能力最强的之一，但天然的BMP
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2数量有限，活性不稳定，远不能满足临床需求，而且其在混入载体后有许多的副作用，例如降低支架材料的力学性能、蛋白有效成分释放不稳定等。
[0005]藤壶作为一种强势的海洋污损生物，能够永久黏附于水下设施，其实现粘附的关键在于多组分的藤壶胶。按照分子量的大小，藤壶胶目前被分为cp100k、cp52k、cp68k、cp20k、cp19k、cp16k。其中cp20k(藤壶胶蛋白20K，cement protein 20k，简称cp20k)被认为是一种界面蛋白，可能起到粘附和生物矿化的双重作用。但由于其序列中含有较多的半胱氨酸而导致其在表达纯化过程中发生絮凝，难以对其生物功能进行确定及应用。目前已有对于藤壶的水下粘附机制的研究，例如中国专利申请号201510534230.0生物粘合剂及其制备方法和应用，其中生物粘合剂包括Trx
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Balcp19k蛋白，其制备方法包括反转录、扩增、构建重组质粒、转化、诱导、亲和层析、透析等步骤，该专利技术的生物粘合剂粘附性能强、产量相对高、制备成本低，可应用于生理材料之间、非生理材料之间、生理材料和非生理材料之间的粘附。由于藤壶胶含有较多的半胱氨酸，难以从已经固化的蛋白胶中提取，且cp20k经大肠杆菌异源表达后容易形成分子间二硫键而发生大规模絮凝，不利于确定其发挥活性状态及具体的生物功能，极大地限制了相关研究工作的开展。例如，Mohanram及Akshita Kumar
等人分别采用核磁共振技术及分子动力学模拟的方法研究了cp20k的空间结构及其于碳酸钙之间的分子相互作用，在理论层面对cp20k的功能进行了推测，但无法通过实验加以验证。
[0006]因此，通过研究cp20k衍生多肽的生物功能，进而进行具备优异组织相容性及促进成骨矿化能力的替代材料的研发，具有重要的应用价值。

技术实现思路

[0007]针对藤壶胶含有较多的半胱氨酸，难以从已经固化的蛋白胶中提取，且大肠杆菌异源表达后容易形成分子间二硫键而发生大规模絮凝，不利于确定其发挥活性状态及具体的生物功能的问题，本专利技术提供了具有自组装特性和生物矿化功能的藤壶胶蛋白20K衍生多肽、其制备方法和应用，即具有自组装特性和生物矿化功能的cp20k
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p3、其制备方法和应用。首先采用序列比对，挖掘cp20k氨基酸序列中潜在的功能片段，通过缩短片段长度、减少半胱氨酸进而降低二硫键数量，并充分挖掘cp20k生物功能。
[0008]为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：
[0009]具有自组装特性和生物矿化功能的藤壶胶蛋白20K衍生多肽的制备方法，包括如下步骤：
[0010]1)用DTT溶液处理cp20k样品，使用移液枪吹打均匀，再添加相应体积的4
×
Loading Buffer混合之后放入PCR扩增仪中加热，制样完成后使用电泳仪进行跑胶，然后取下胶片加入固定液固定、染色，倒掉染色液加入10％的乙酸溶液室温过夜脱色；
[0011]2)cp20k
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p3野生型及其突变体的合成与鉴定：通过序列分析，将cp20k中含有的保守的重复序列和贻贝粘附蛋白mfp
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2的结构域(Epidermal Growth Factor，简称EGF，即表皮生长因子)作比较，找到cp20k的重复序列与EGF结构域中在序列上的相似性序列，选取CNQKHPCWRRHGKKHGLHRKFHGNACNC，命名为cp20k
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p3，采用丙氨酸扫描法将cp20k
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p3中的半胱氨酸逐个突变成丙氨酸；
[0012]3)cp20k
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p3野生型及其突变体的自组装特性检测：
[0013]取新鲜剥离的云母片，分别取步骤2)得到的cp20k
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p3野生型及其突变体溶液滴加到云母片上，室温自然干燥后对其进行AFM观察拍摄；
[0014]分别取步骤2)得到的cp20k
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p3野生型及其突变体多肽在液体池中进行CD测量，光谱范围为190
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260nm；之后在190
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260nm的范围内进行圆二色谱测试，使用spectra manager软件对CD光谱数据进行平滑预处理，保存上传至http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk网站，波数范围选择190到240nm，进行拟合计算得到二级结构相对含量；
[0015]4)cp20k
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p3野生型及其突变体的生物相容性及生物矿化功能检测：
[0016]CCK
‑
8实验：接种mMSCs细胞悬液于96孔板中，在37℃细胞培养箱中培养24小时，之后将步骤2)得到的cp20k
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p3野生型及其突变体与mMSCs共培养48小时后，每孔加入CCK8试剂培养1小时后，在450nm处测定吸光值，检测多肽对细胞的毒性，每个样品进行3次重复，使用Origin绘图软件处理数据；
[0017]茜素红染色实验：将mMSCs接种于6孔板中，在α
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MEM培养基中进行培养72小时后，更换分化培养基，孵育7天，每3天更本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.具有自组装特性和生物矿化功能的藤壶胶蛋白20K衍生多肽的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：1)用DTT溶液处理cp20k样品，使用移液枪吹打均匀，再添加相应体积的4
×
Loading Buffer混合之后放入PCR扩增仪中加热，制样完成后使用电泳仪进行跑胶，然后取下胶片加入固定液固定、染色，倒掉染色液加入10％的乙酸溶液室温过夜脱色；2)cp20k
‑
p3野生型及其突变体的合成与鉴定：通过序列分析，将cp20k中含有的保守的重复序列和贻贝粘附蛋白mfp
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2的结构域作比较，找到cp20k的重复序列与EGF结构域中在序列上的相似性序列，选取CNQKHPCWRRHGKKHGLHRKFHGNACNC，命名为cp20k
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p3，采用丙氨酸扫描法将cp20k
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p3中的半胱氨酸逐个突变成丙氨酸；3)cp20k
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p3野生型及其突变体的自组装特性检测：取新鲜剥离的云母片，分别取步骤2)得到的cp20k
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p3野生型及其突变体溶液滴加到云母片上，室温自然干燥后对其进行AFM观察拍摄；分别取步骤2)得到的cp20k
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p3野生型及其突变体多肽在液体池中进行CD测量，光谱范围为190
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260nm；之后在190
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260nm的范围内进行圆二色谱测试，使用spectra manager软件对CD光谱数据进行平滑预处理，保存上传至http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk网站，波数范围选择190到240nm，进行拟合计算得到二级结构相对含量；4)cp20k
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p3野生型及其突变体的生物相容性及生物矿化功能检测：CCK
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8实验：接种mMSCs细胞悬液于96孔板中，在37℃细胞培养箱中培养24小时，之后将步骤2)得到的cp20k
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p3野生型及其突变体与mMSCs共培养48小时后，每孔加入CCK8试剂培养1小时后，在450nm处测定吸光值，检测多肽对细胞的毒性，每个样品进行3次重复，使用Origin绘图软件处理数据；茜素红染色实验：将mMSCs接种于6孔板中，在α
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MEM培养基中进行培养72小时后，更换分化培养基，孵育7天，每3天更换一次分化培养基，之后使用pH4.2的茜素红
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S染料在pH＝4.2条件下对细胞进行染色。2.权利要求1所述的具有自组装特性和生物矿化功能的藤壶胶蛋白20K衍生多肽的制备方法，其特征在于：步骤1)是配制浓度为60mM的DTT溶液处理cp20k样品，取10ul一定浓度的cp20k悬浊液与10ul 60mM DTT进行混合，使用移液枪吹打均匀，再添加相应体积的4
×
Loading Buffer混合之后放入PCR扩增仪中70℃加热10min，制样完成后使用电泳仪进行跑胶，220V，120mA，10min，之后将电流调至80mA跑30min，取下胶片加入固定液固定5min，之后染色5小时，倒...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋俊祎，胡碧茹，李保山，梁超，叶宗煌，曾玲，刘梁程，淦克胜，吴吉喆，唐佳文，
申请(专利权)人：中国人民解放军国防科技大学，
类型：发明
国别省市：