神经肽Gm-Crz及其受体在梨小食心虫防治中的应用制造技术

本申请提供了梨小食心虫神经肽Gm

【技术实现步骤摘要】
神经肽Gm
‑
Crz及其受体在梨小食心虫防治中的应用


[0001]本申请属于生物
和农业害虫防治领域，具体地，本申请提供了梨小食心虫神经肽Gm
‑
Crz及其受体，以及其在梨小食心虫防治中的应用。

技术介绍

[0002]梨小食心虫是世界性的重要果树害虫。由于该类害虫幼虫蛀果隐蔽为害，药剂防治效果不太理想，而成虫期是一个绝佳的防治时期。梨小食心虫成虫具有强大的生育能力，通过阻碍梨小食心虫的正常生殖防治该害虫具有重要的研究意义。
[0003]因此，开展梨小食心虫成虫生殖力的神经调控研究，既有助于研发防控梨小食心虫成虫的特异性控制剂，又对果园害虫的防治有着十分重要的应用前景。

技术实现思路

[0004]本专利技术首次在梨小食心虫中发现梨小食心虫神经肽Gm
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Crz及其受体Gm
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CrzR并明确了具体的组织表达模式；该梨小食心虫神经肽Gm
‑
Crz能够与梨小食心虫体内的受体Gm
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CrzR结合，两者还能够调控梨小食心虫雄虫精液蛋白的产生，从而调控生殖力。
[0005]一方面，本申请提供了梨小食心虫神经肽Gm
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Crz，其氨基酸序列为SEQ ID NO.28。
[0006]另一方面，本申请提供了梨小食心虫神经肽Gm
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Crz基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.27。
[0007]另一方面，本申请提供了梨小食心虫神经肽受体Gm/>‑
CrzR，其氨基酸序列为SEQ ID NO.26。
[0008]另一方面，本申请提供了梨小食心虫神经肽受体Gm
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CrzR基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.25。
[0009]另一方面，本申请提供了上述梨小食心虫神经肽或其基因，梨小食心虫神经肽受体或其基因的拮抗剂或干扰剂在制备防治梨小食心虫的药剂中的应用。
[0010]另一方面，本申请提供了防治梨小食心虫的方法，包括施用上述梨小食心虫神经肽或其基因，梨小食心虫神经肽受体或其基因的拮抗剂或干扰剂。
[0011]进一步地，所述拮抗剂或干扰剂为RNA干扰试剂。
[0012]进一步地，所述RNA干扰试剂为dsRNA，合成所述dsRNA的模板序列为SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30。
[0013]进一步地，所述药剂或方法降低梨小食心虫雄虫附腺中精液蛋白含量。
[0014]进一步地，所述药剂或方法降低交配后梨小食心虫雌虫的产卵率和孵化率。
[0015]有益效果：
[0016]本专利技术表明沉默神经肽Crz及受体CrzR能够显著降低梨小食心虫雄虫的精液蛋白分泌，从而降低生殖力。本专利技术提供的梨小食心虫神经肽Crz的配体多肽与其受体CrzR具有很好的结合能力，证明本专利技术提供的配体具有体外活性，提供的配体多肽和编码该配体多肽的DNA可以用于针对该GPCR开发梨小食心虫特异性控制剂。按照本专利技术中的重组GPCR蛋
白的表达体系以及配体
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受体结合活性测定系统，可以筛选梨小食心虫神经肽Crz特异性的成熟肽类似物，通过外源性配体阻断或者过度刺激筛选激动剂或拮抗剂，中断梨小食心虫的正常生殖，用于梨小食心虫的防治，在制备新型特异性无公害杀虫剂方面有潜在的应用前景。
附图说明
[0017]图1为Gm
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Crz基因的前体序列结构图；其中，下划线表示信号肽；灰色阴影表示预测的成熟肽序列；字体加框表示酰胺化信号；字体加粗表示断裂位点。
[0018]图2为Gm
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CrzR基因的ORF序列结构图；其中，灰色阴影表示7个跨膜结构域。
[0019]图3为梨小食心虫雄虫Gm
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Crz和Gm
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CrzR基因表达模式图；其中A：Gm
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Crz基因表达模式；B：Gm
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CrzR基因表达模式；C：梨小食心虫雄性生殖系统解剖图；D：Gm
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CrzR基因在雄性生殖系统中的表达模式。图中数据表示平均值
±
标准误，不同字母表示不同组之间的显著性差异(P<0.05)。
[0020]图4为不同梯度浓度的Gm
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Crz及Gm
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AKH(对照)刺激对转染pcDNA3.1(+)/Gm
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CrzR质粒的CHO细胞内的Ca
2+
浓度的影响。
[0021]图5为RNA干扰Gm
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Crz及Gm
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CrzR基因的效应；其中，A为Gm
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Crz基因的RNA干扰效率；B为Gm
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CrzR基因的RNA干扰效率。。
[0022]图6为Gm
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Crz及Gm
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CrzR基因对梨小食心虫雄虫附腺精液蛋白的影响。
[0023]图7为Gm
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Crz及Gm
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CrzR基因对梨小食心虫雄虫生殖力的影响；统计指标为与之交配雌虫的7日产卵量(A)以及卵孵化量(B)。
具体实施方式
[0024]实验材料：
[0025]梨小食心虫的成虫，来自中国农业大学植物保护学院昆虫系IPM实验室人工饲养的种群，已连续繁育多代。选取生活力较强的梨小食心虫成虫，当天使用。梨小食心虫的成虫饲养在一次性透明的塑料盒中，饲喂浓度为5％的蜂蜜水，雌虫在塑料盒内壁产卵，然后将其剪成卵卡放在装有苹果的新的透明塑料盒中，饲养在设置光周期为14光照：10黑暗，温度为25
±
2℃和70％相对湿度的人工气候培养箱中。
[0026]统计分析方法：
[0027]所有的统计均用GraphPad Prism 7.00软件进行分析。多重数据比较实验采用ANOVA的Turkey
’
s HSD多重比较检验，不同的小写字母表示有显著差异(P*<0.05)。使用非线性曲线拟合，计算得到有效中浓度(50％effective concentrations，EC
50
)值。干扰效率的差异统计利用Two
‑
tailed Student's T检验(P**<0.01)。产卵量与卵孵化率的比较采用Mann
–
Whitney U检验(P*<0.05；P**<0.01)。
[0028]实施例1梨小食心虫Gm
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Crz和Gm
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CrzR基因序列的获取和分析
[0029]梨小食心虫Gm
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Crz和Gm
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CrzR基因的ORF序列的获取：
[0030]基于本实验构建的梨小食心虫中枢神经系统转录组数据库(NCBI SRA登录号本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.梨小食心虫神经肽Gm
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Crz，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID NO.28。2.梨小食心虫神经肽Gm
‑
Crz基因，其特征在于，其核苷酸序列为SEQ ID NO.27。3.梨小食心虫神经肽受体Gm
‑
CrzR，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID NO.26。4.梨小食心虫神经肽受体Gm
‑
CrzR基因，其特征在于，其核苷酸序列为SEQ ID NO.25。5.根据权利要求1
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4任一项所述的梨小食心虫神经肽或其基因，梨小食心虫神经肽受体或其基因的拮抗剂或干扰剂在制备防治梨小食心虫的药剂中的应用。6.防治梨小食心虫的方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘小侠，程杰，张松斗，李贞，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：