一种串联多拷贝酵母生物合成芋螺毒素的方法技术

本发明专利技术公开了一种串联多拷贝酵母生物合成芋螺毒素的方法。本发明专利技术将进行过密码子偏爱性优化人工合成的芋螺毒素基因，通过编码蛋白酶切位点的碱基对连接，从而形成串联多拷贝基因，并将其克隆至带有sfGFP筛选信号的表达载体，转入酵母后获得表达芋螺毒素的酵母工程菌，制备芋螺毒素。本发明专利技术采用的多拷贝串联表达技术能较为有效的提高酵母表达芋螺毒素的产量，并且对芋螺毒素的生物活性无显著影响，安全性极高，所得到的表达产物可用于制备治疗神经性等疾病的潜在药物。神经性等疾病的潜在药物。

【技术实现步骤摘要】
一种串联多拷贝酵母生物合成芋螺毒素的方法


[0001]本专利技术涉及芋螺毒素生物合成的方法，尤其涉及一种串联多拷贝酵母生物合成芋螺毒素的方法，属于芋螺毒素的基因工程制备领域。

技术介绍

[0002]芋螺毒素（Conotoxins），是芋螺在捕食时所使用的毒素的统称，其种类繁多，且能对神经系统表面多种受体产生影响，已成为药理学和神经科学中有力的工具。目前，无论时通过化学合成或者生物合成，所获得的芋螺毒素产量都无法满足实际使用中的需求，且化学合成的成本很高。本专利技术采用芋螺毒素成熟肽基因，将其通过编码蛋白酶切位点的序列连接形成多拷贝基因，再连接真核生物的信号肽，构建酵母表达的重组质粒，建立酵母表达系统用于获取芋螺毒素。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供一种串联多拷贝酵母生物合成芋螺毒素的方法。
[0004]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：1）GenBank 中检索获得芋螺毒素成熟肽基因，按照毕赤酵母对遗传密码子的偏爱性对反翻译芋螺毒素成熟肽基因进行密码子优化，并将多个密码子优化后的成熟肽基因拷贝通过中间加入含有编译蛋白酶切割位点的碱基序列串联连接；2）重组产生的多拷贝芋螺毒素基因克隆至pPink
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HC
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MF
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GFP质粒中；3）重组表达载体转入毕赤酵母中，筛选重组酵母表达菌；4）对同源重组成功的毕赤酵母进行诱导表达，从而得到分泌表达的多拷贝芋螺毒素融合蛋白；5）通过使用蛋白酶对纯化过后的多拷贝芋螺毒素融合蛋白进行酶切，并再次纯化。
[0005]其中，所述的芋螺毒素基因的核苷酸序列可以是任何一种芋螺毒素基因的核苷酸序列。核苷酸序列是通过酵母密码子偏爱优化后的核苷酸序列。所使用的编码蛋白酶切位点的序列可以是任何一种蛋白酶切位点序列，多拷贝基因中的串联拷贝数目是6个拷贝以内。
[0006]所述的带有sfGFP标签的表达载体为pPink
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HC，超折叠绿色荧光蛋白（superfolder green fluorescent protein，sfGFP），sfGFP 是无毒的，它可在不同的有机体中，高水平地予以表达，而对有机体的生理学影响很小的。此外，GFP与目的蛋白融合表达时可保持其荧光的发射能力，对目的蛋白活性影响小。酵母表达系统是目前基因工程中成熟的表达方法。本专利技术采用了载体作为蛋白表达载体,该载体的特点是带有sfGFP标签，会产生sfGFP和目的蛋白的融合蛋白。此外，sfGFP上游或下游带有任意的蛋白酶切位点。
[0007]该融合蛋白的序列中，芋螺毒素既可以融合GFP蛋白后，也可以在GFP蛋白前；GFP和连接部分的氨基酸序列允许有多种突变。
[0008]所述的酵母重组表达载体构建包括以下内容：pPinK
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HC载体的酶切及酶切产物回收；芋螺毒素序列和载体的连接；连接产物的鉴定。连接产物的鉴定包括制备感受态细胞、转化反应、重组质粒提取和鉴定。
[0009]针对于大部分芋螺毒素二硫键较多，存在翻译后修饰的特点，本专利技术选用毕赤酵母为宿主菌。毕赤酵母具有真核生物特有的蛋白高效分泌表达，翻译后修饰，因此，近年来毕赤酵母成为表达外源目的蛋白，特别是真核来源的外源蛋白的高效表达系统。
[0010]本专利技术对测序鉴定后质粒,酶切线性化后电转化prb1和pep4双蛋白酶缺陷型毕赤酵母感受态细胞，转化后的细胞涂布于Pichia Adenine Dropout Agar（PAD）平板，挑选单克隆，对克隆进行小量发酵培养，对酵母菌检测荧光，发酵液采用15% SDS
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PAGE分离后，胶上直接观察荧光，以获得表达芋螺毒素的毕赤酵母工程菌。
[0011]发酵液蛋白经Ni
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NTA琼脂糖树脂亲和层析后，使用相应的蛋白酶进行切割，再对所的到的芋螺毒素纯化，采用CCK8测试蛋白活性，结果显示其抑制昆虫细胞系sf9生长，具有细胞毒性。
[0012]本专利技术的有益效果在于：（1）芋螺毒素保守估计有5万种，而仅有两三个芋螺毒素在酵母中可直接表达成功，表明芋螺毒素在酵母中直接表达成功率极低。这可能原因是芋螺肽分子量小，具有毒性，表达量极低或易被宿主降解。本专利技术采用酵母表达芋螺毒素时，加入sfGFP作为荧光筛选信号，同时其可作为保护蛋白与芋螺毒素融合表达，成功制备芋螺毒素，通过串联多拷贝的方式，将芋螺毒素表达产量提高多倍。该技术具有通用性，作为一个芋螺毒素表达平台，可将不同的芋螺毒素在酵母中成功表达。
[0013]（2）本专利技术采用基因工程技术，构建sfGFP融合蛋白的质粒，以毕赤酵母为宿主，成功表达多拷贝串联芋螺毒素与GFP的融合蛋白。通过进一步酶切GFP后，获得芋螺毒素小肽，进行药物研发。本专利技术制备芋螺毒素的方法具有通用性强、表达效率较高、具有生物活性、成本低、易规模化生产等优点。
[0014]（3）本专利技术相较于芋螺毒素的单拷贝表达，使得芋螺毒素的产量提高2
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4倍，且并未增加生产工序，生产成本基本与单拷贝表达持平。
附图说明
[0015]图1：酵母表达的SrIA*2
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GFP，SrIA*4
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GFP，SrIA*6
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GFP蛋白。
[0016]图2：芋螺肽酶切后的sfGFP抗体免疫印迹检测酶切情况。小带为切下来的sfGFP。泳道M为marker，泳道0为未切割的融合蛋白，泳道1为1UrTEV蛋白酶切割后的融合蛋白，泳道2为2UrTEV蛋白酶切割后的融合蛋白。
[0017]图3：芋螺肽对Sf9细胞增殖的抑制作用。误差条（Error bar）表示平均值
±
SD标准偏差（n = 3）；测试组对比与阴性对照GFP组，用Graphad prism 8进行Student
’
s t
‑
test显著性分析，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。
[0018]图4：芋螺肽对斑马鱼胚胎发育(48h)致死的影响。 A，对照组， B，芋螺肽处理组。
具体实施方式
[0019]为了使本专利技术所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本专利技术所述的
技术方案做进一步的说明，但是本专利技术不仅限于此。
[0020]本专利技术中所述的YPDS培养基是由酵母膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，山梨醇1M，加水至1L，121℃灭菌20分钟制成。
[0021]本专利技术中所述的PAD固体培养基是由马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g，加水至1L，121℃灭菌20分钟制成。
[0022]本专利技术中所述的BMMY培养基是由酵母粉10g、蛋白胨20g、KH2PO
4 11.8g、K2HPO
4 3g，加水至890mL，121℃灭菌20分钟，温度降至60℃以下时加入浓度13.4g/L过滤灭菌的YNB溶液100m本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种在毕赤酵母中串联多拷贝基因表达芋螺毒素的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）在GenBank中检索获得芋螺毒素成熟肽基因，按照毕赤酵母对遗传密码子的偏爱性对反翻译芋螺毒素成熟肽基因进行密码子优化，并将多个密码子优化后的成熟肽基因拷贝通过中间加入含有编译蛋白酶切割位点的碱基序列串联连接；2）重组产生的多拷贝芋螺毒素基因克隆至pPink
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【专利技术属性】
技术研发人员：缪颖，伍炳华，林泽胤，余嘉伟，郑磊，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：