高活性植物凝集素的分离纯化工艺制造技术

本发明专利技术公开了高活性植物凝集素的分离纯化工艺，包括将豆子使用纯水充分浸泡后，脱皮，脱皮后的豆子与缓冲液混合，破壁处理，得到浆液；将浆液充分搅拌，使PHA充分溶出；初步去除杂质得到PHA粗提液；之后依次使用SP离子交换色谱和DEAE离子交换色谱纯化，得到PHA

【技术实现步骤摘要】
高活性植物凝集素的分离纯化工艺


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种高活性植物凝集素的分离纯化工艺。

技术介绍

[0002]豆科植物凝集素(Phytohemagglutinin,PHA)是一种从豆科植物种子中提取的糖基化修饰蛋白，是由两种高同源性而生物活性不同的亚基构成的四聚体糖蛋白，其包括E亚基组成的红细胞凝集素(PHA
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E)，以及L亚基组成的白细胞凝集素(PHA
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L)。PHA
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E具有较高的凝血活性，可以促使红细胞凝集，PHA
‑
L具有较高的有丝裂原活性。其中，PHA多作为高效免疫增强剂在生物医学领域使用，其主要是因为PHA
‑
L可与哺乳动物血细胞(如淋巴细胞)上的蛋白糖基结合，产生非特异性刺激活性，促使淋巴细胞分裂增值，具有多种免疫效应，如可作为作为生物免疫反应因子用于评估机体的免疫机能。
[0003]盐析法纯化蛋白时，具有处理工艺简单，处理量大的、成本低廉、不会破坏蛋白结构的优势。因此在传统的PHA的提取工艺中，常采用盐析沉淀作为粗纯方法，离子交换与凝胶过滤层析联用作为进一步的精纯方法，具体为：粉碎，浸泡提取浸提液
→
硫酸铵分级沉淀
→
DEAE阴离子交换层析
→
凝胶过滤层析。现有的植物凝集素分离纯化工艺主要还是沿用常规的蛋白纯化方法，为了进一步提高纯度，一般会通过多次离子交换层析或凝胶过滤层析后才能获得较高纯度的植物凝集素，并且硫酸铵分级沉淀后需要进行换液透析。如王超等人在《豆类凝集素的提取分离及纯化》中，采用硫酸铵分级沉淀进行凝集素的纯化，DEAE
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52阴离子交换层析柱
→
Superdex
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200层析柱进行分离纯化。如陈高等人在《菜豆鲜荚中菜豆凝集素的提取与分离纯化工艺研究》中，采用硫酸铵分级沉淀、DEAE
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52阴离子交换层析和Superdex
‑
200凝胶过滤层析的组合方法用于分离纯化菜豆凝集素；肖俊琪等人在《赤小豆凝集素的分离纯化及电泳分析》中，采用硫酸铵分级沉淀进行粗纯，Q Sepharose XL阴离子交换柱
→
疏水层析色谱
→
凝胶过滤层析进行进一步分离纯化。
[0004]此外，亲和层析法也常用于凝集素的纯化提取，如张柏林等人在《大豆凝集素纯化及凝集活性测定的研究》中采用N
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乙酰基
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D
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半乳糖胺
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epoxy
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sepharose 6B亲和层析体系进行大豆凝集素的精纯，提纯的大豆凝集素各条带在30KD，凝集素纯度高。虽然亲和层析法能满足高纯度、高得率以及纯化步骤少等要求，但较高的填料成本以及无法在较长色谱柱中或批量分离的局限性，使得亲和层析法的应用目前仅局限于实验室阶段，无法大批量工业化生产。
[0005]虽然以上方法均是对植物凝集素(PHA)的纯化提取方法，但实际得到的PHA均是包含了E亚基和L亚基的四聚体混合物，其无法将植物凝集素的E亚基和L亚基进行进一步的分离纯化提取，且未对具有有丝分裂原活性的PHA
‑
L的纯度和活性进行进一步检测，将其用于免疫细胞的非特异性刺激剂时，容易导致测试样本的不确定率增加，难以反应免疫细胞的真实状态。CN112707958A公开了一种提取L型和E型植物凝集素的方法，其通过对豆子进行浸泡，破碎、离心、硫酸铵分级沉淀等步骤进行蛋白粗提，然后通过疏水层析和离子交换层析对L型和E型植物凝集素进行分离和纯化，虽然可分别对PHA
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L和PHA
‑
E两种亚型进行分别
分离提取，但其仍然避免不了采用硫酸铵分级沉淀步骤。
[0006]由于现有工艺的局限，需要一种高效、适合大批量工业生产的高活性高纯度的PHA
‑
L天然豆科植物凝集素的提纯工艺。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种高活性植物凝集素的分离纯化工艺。
[0008]专利技术人研究发现，在PHA的提取过程中，盐析处理，特别是硫酸铵盐析处理，对PHA的结构有一定的破坏，直接导致后续PHA的分离纯化难以制备得到高活性、高纯度的PHA。
[0009]本专利技术所采取的技术方案是：
[0010]一种利于得到高活性植物凝集素的分离纯化工艺，包括如下步骤：
[0011]步骤1：前处理：
[0012]将豆子使用纯水充分浸泡后，与缓冲液混合，破壁处理，得到浆液；
[0013]将浆液充分搅拌，使PHA充分溶出；
[0014]调节浆液的pH为4.5～5.5，固液分离，取上清，得到PHA粗提液；或固液分离，调节豆浆的pH为4.5～5.5后去除沉淀，取上清，得到PHA粗提液；
[0015]步骤2：SP离子交换色谱纯化：
[0016]将PHA粗提液上样在SP离子交换色谱柱，使用缓冲液梯度洗脱，收集得到PHA洗脱液；
[0017]所述梯度洗脱用的缓冲液选自NaAC
‑
HAc缓冲液、柠檬酸
‑
氢氧化钠缓冲液、磷酸氢二钠
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柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸氢二钠
‑
磷酸二氢钾缓冲液中的至少一种；
[0018]步骤3：换液：
[0019]将PHA洗脱液的缓冲体系切换为Tris、HEPES、MOPS、TEA、磷酸氢二钾或硼酸钠缓冲液体系；
[0020]步骤4：DEAE离子交换色谱纯化：
[0021]使用DEAE离子交换色谱对换液后的PHA洗脱液进行洗脱纯化，得到PHA
‑
L蛋白溶液。
[0022]在一些分离纯化工艺的实例中，步骤1中使用的所述缓冲液的pH＝4.5～7.4。
[0023]在一些分离纯化工艺的实例中，步骤1中使用的所述缓冲液选自NaAC
‑
HAc缓冲液、柠檬酸
‑
氢氧化钠缓冲液、磷酸氢二钠
‑
柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸氢二钠
‑
磷酸二氢钾缓冲液中的至少一种。
[0024]在一些分离纯化工艺的实例中，步骤1中使用的所述缓冲液的浓度不超过50mM。
[0025]在一些分离纯化工艺的实例中，步骤2中使用的所述缓冲液的pH＝4.5～7.4。
[0026]在一些分离纯化工艺的实例中，步骤2中使用的所述缓冲液的浓度不超过50mM。
[0027]在一些分离纯化工艺的实例中，步骤3中使用的所述缓冲液的浓度不超过50mM。
[0028]在一些分离纯化工艺的实例中，所述豆子脱皮后再与缓冲液混合。
[0029]在一些分离纯化工艺的实例中，经充分搅拌得到的所述浆液先经至少12h冷冻后，并经解冻复融，再调节浆液的pH为4.5～5.5。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利于得到高活性植物凝集素的分离纯化工艺，包括如下步骤：步骤1：前处理：将豆子使用纯水充分浸泡后，与缓冲液混合，破壁处理，得到浆液；将浆液充分搅拌，使PHA充分溶出；调节浆液的pH为4.5～5.5，固液分离，取上清，得到PHA粗提液；或固液分离，调节豆浆的pH为4.5～5.5后去除沉淀，取上清，得到PHA粗提液；步骤2：SP离子交换色谱纯化：将PHA粗提液上样在SP离子交换色谱柱，使用缓冲液梯度洗脱，收集得到PHA洗脱液；所述梯度洗脱用的缓冲液选自NaAC
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HAc缓冲液、柠檬酸
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氢氧化钠缓冲液、磷酸氢二钠
‑
柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸氢二钠
‑
磷酸二氢钾缓冲液中的至少一种；步骤3：换液：将PHA洗脱液的缓冲体系切换为Tris、HEPES、MOPS、TEA、磷酸氢二钾或硼酸钠缓冲液体系；步骤4：DEAE离子交换色谱纯化：使用DEAE离子交换色谱对换液后的PHA洗脱液进行洗脱纯化，得到PHA
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L蛋白溶液。2.根据权利要求1所述的分离纯化工艺，其特征在于：步骤1中，所述豆子脱皮后再与缓冲液混合。3.根据权利要求1所述的分离纯化工艺，其特征在于：步骤1中，经充分搅拌得到的所述浆液先经至少12h冷冻后，并经解冻复融，再调节浆液的pH为4.5～5.5。4.根据权利要求1所述的分离纯化工艺，其特征在于：步骤1中使用的所述缓冲液的pH=4.5～7.4；和/或步骤1中使用的所述缓冲液选自NaAC
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HAc缓冲液、柠檬酸
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【专利技术属性】
技术研发人员：杨翔，黄彬，谢桂华，
申请(专利权)人：广州市雷德生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：