一种提取L型和E型植物凝集素的方法技术

本发明专利技术涉及植物提取技术领域，公开了一种提取L型和E型植物凝集素的方法。本发明专利技术所述方法通过对豆子进行浸泡，破碎、离心、硫酸铵分步沉淀等步骤进行蛋白粗提，然后通过疏水层析和离子交换层析对L型和E型植物凝集素进行分离和纯化。本发明专利技术所述方法操作简单，而且提取的L型和E型植物凝集素纯度高，适合于大规模的生产L型和E型植物凝集素。产L型和E型植物凝集素。

【技术实现步骤摘要】
一种提取L型和E型植物凝集素的方法


[0001]本专利技术涉及植物提取
，具体的说是涉及一种提取L型和E型植物凝集素的方法。

技术介绍

[0002]植物凝集素(Phytohemagglutinin PHA)是从豆科植物种子中提取的一种含糖蛋白质。PHA又分为E型和L型，其中PHA
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E型具有红细胞凝集作用；PHA
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L型能够刺激淋巴细胞转化，是人类淋巴细胞有丝分裂的刺激剂，即在PHA
‑
L作用下，原处于G0期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，进而进行有丝分裂。
[0003]现有专利技术中也有对植物凝集素PHA进行提取的方法，目前已经公开了多种从豆科植物中提取植物凝集素的方法。如公开号为CN101508730A的中国专利技术专利申请中公开了一种豆类植物凝集素的提取方法，是用超声和微波在40
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60℃水浴条件下提取植物凝集。公开号为CN101340923A的中国专利技术专利申请中公开了用乙醇沉淀的菜豆提取物。CN 110283242 A中对PHA进行提取，该专利中，取豆子浸提液离心后取上清液，用酸调整上清液的pH至4.5
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5.0，得酸调混合液；酸调混合液离心后取上清液，在上清液中加入质量浓度0.1
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0.4％的氯化钠溶液，然后离心取上清液，即为PHA(所有亚型PHA)。但以上公开专利中并无提及PHA亚型的分离方法。
[0004]现有专利CN103833839A公开了一种C型凝集素及其制备方法，但是该C型凝集素以鳞翅目天蚕蛾科昆虫的血淋巴为原料，对于植物凝集素的提取分离没有很大的参考价值。现有国内尚无豆子中提取植物凝集素PHA
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L和PHA
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E两种亚型提取方式相关报道。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种从豆科植物中提取L型和E型植物凝集素的方法，使得所述方法能够同时获得两种亚型植物凝集素并具有较高纯度，工艺简便，成本较低。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0007]一种提取L型和E型植物凝集素的方法，包括：
[0008]步骤1、豆子加水破碎并离心去除不溶性物质，然后调节pH值为4.4
‑
5.0(用于去除豆子中的豆清蛋白，豆清蛋白含量太高会影响后续纯化效果)，搅拌，离心留取上清；
[0009]步骤2、所述上清用硫酸铵分级沉淀法沉淀蛋白；
[0010]步骤3、沉淀的蛋白溶解后继续添加硫酸铵至饱和度25％
‑
35％，过滤取滤液；
[0011]步骤4、滤液进行疏水层析，上样后收集流穿组分，获得L型植物凝集素；然后采用阶梯型洗脱方法，洗脱液为tris
‑
HCl，洗脱液浓度分别为10％、20％、40％三个梯度，每个梯度3
‑
5个柱体积，收集40％梯度洗脱组分为E型植物凝集素；
[0012]步骤5、所述流穿组分和40％梯度洗脱组分用tris
‑
HCl透析，对透析后的两个组分分别用离子交换层析纯化，洗脱液为tris
‑
HCl，采用10％梯度洗脱的方式进行3
‑
5个柱体积
洗脱，均收集10％洗脱组分，获得纯化后的PHA
‑
L型和PHA
‑
E型植物凝集素。
[0013]作为优选，步骤1中豆子与水的质量体积比为1g:10mL。其中，豆子用水在4℃条件下先浸泡12
‑
24h，然后破碎(破碎温度不超过25℃，破碎温度达到25℃，停止破碎，并预冷至4
‑
25℃后再进行破碎)，破碎完毕后，用量筒计量破碎液体积，并在4
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25℃条件下搅拌6
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12h，10000rpm离心30min，留离心上清组分用于后续调节pH值，所述豆子可以是红芸豆、红腰豆、花腰豆、白芸豆中的一种或两种以上。
[0014]作为优选，步骤2为：所述上清用硫酸铵分两级沉淀蛋白，第一级硫酸铵饱和度为20
‑
35％，第二级硫酸铵饱和度为35
‑
65％，第二级硫酸铵饱和度大于第一级硫酸铵饱和度。
[0015]更具体地，所述步骤2为：
[0016]步骤2.1、所述上清加硫酸铵至20
‑
35％饱和度，搅拌，离心，保留上清组分；
[0017]步骤2.2、步骤2.2中获得的上清组分继续加硫酸铵至35
‑
65％饱和度，搅拌，离心，弃上清，留蛋白沉淀。
[0018]作为优选，步骤3中沉淀的蛋白用tris
‑
HCl溶解。更具体地是用0.2M Tris
‑
HCl pH8.0溶解，定容至豆子破碎后的溶液量，待沉淀完全溶解后添加固体硫酸铵至饱和度30％，0.45um滤膜过滤，取滤液。
[0019]作为优选，步骤4中疏水层析采用Butyl
‑
sepharose 4FF。所用平衡缓冲液为0.02M tris
‑
HCl30％(NH4)2SO
4 pH8.0，洗脱缓冲液为0.02M tris
‑
HCl pH8.0。
[0020]作为优选，所述流穿传组分和40％梯度洗脱组分用缓冲液0.02Mtris
‑
HCl pH8.0进行透析，所用缓冲液与上述两种组分体积比为100:1，每3h换液一次，总透析三次。
[0021]作为优选，步骤5中离子交换层析纯化采用DEAE sepharose 4FF进行纯化。平衡缓冲液为0.02Mtris
‑
HCl pH8.0，洗脱液为0.02Mtris
‑
HCl 1M NaCl pH8.0。
[0022]由以上技术方案可知，本专利技术所述方法通过对豆子进行浸泡，破碎、离心、硫酸铵分步沉淀等步骤进行蛋白粗提，然后通过疏水层析和离子交换层析对L型和E型植物凝集素进行分离和纯化。本专利技术所述方法操作简单，而且提取的L型和E型植物凝集素纯度高，适合于大规模的生产L型和E型植物凝集素。
附图说明
[0023]图1所示为PHA
‑
L和PHA
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E疏水层析Butyl
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sepharose 4FF填料纯化出峰位置图；
[0024]图2所示为PHA
‑
L和PHA
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E使用离子交换层析DEAE
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sepharose 4FF纯化出峰位置图；
[0025]图3所示为PHA
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L和PHA
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E的SDS
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PAGE分析结果。
具体实施方式
[0026]本专利技术实施例公开了一种提取L型和E型植物凝集素的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提取L型和E型植物凝集素的方法，其特征在于，包括：步骤1、豆子加水破碎并离心去除不溶性物质，然后调节pH值为4.4
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5.0，搅拌，离心留取上清；步骤2、所述上清用硫酸铵分级沉淀法沉淀蛋白；步骤3、沉淀的蛋白溶解后继续添加硫酸铵至饱和度25％
‑
35％，过滤取滤液；步骤4、滤液进行疏水层析，上样后收集流穿组分，获得L型植物凝集素；然后采用阶梯型洗脱方法，洗脱液为tris
‑
HCl，洗脱液浓度分别为10％、20％、40％三个梯度，每个梯度3
‑
5个柱体积，收集40％梯度洗脱组分为E型植物凝集素；步骤5、所述流穿组分和40％梯度洗脱组分用tris
‑
HCl透析，对透析后的两个组分分别用离子交换层析纯化，洗脱液为tris
‑
HCl，采用10％梯度洗脱的方式进行3
‑
5个柱体积洗脱，均收集10％洗脱组分，获得纯化后的PHA
‑
L型和PHA
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E型植物凝集素。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：任晓光，岳试超，周同喜，赵巧辉，李桂林，张春鸽，付豪，苏测洋，吴学炜，付光宇，杨增利，
申请(专利权)人：郑州伊美诺生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：