一种人蜕膜MDSCs的分离方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种人蜕膜MDSCs的分离方法，该分离方法包括步骤：蜕膜组织采集、蜕膜组织进一步清洗、剪碎、消化、终止消化、过滤、单个核细胞获得、细胞贴壁、收集未贴壁细胞、MDSCs分离和流式检测。本发明专利技术使用较温和的Ⅳ型胶原酶进行原代消化分离，与胰酶相比，胶原酶仅对细胞间质有消化作用，避免了胰酶消化时对细胞膜蛋白的破坏作用；消化过程中加入I型DNA酶防止DNA导致的细胞凝集，且对细胞无损伤；通过使用CD33磁珠分选获得高纯度的CD33

【技术实现步骤摘要】
一种人蜕膜MDSCs的分离方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种人蜕膜MDSCs的分离方法。

技术介绍

[0002]骨髓来源的抑制性细胞(Myeloid
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derived suppressor cells，MDSCs)是一群能够表达精氨酸酶、诱导型一氧化氮合酶、吲哚胺2，3
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二氧化酶、白介素10等免疫调节分子对机体免疫反应发挥负向调节作用的免疫细胞群。Bartmann等人报道人蜕膜组织中CD33
+
HLA
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DR
neg and CD33
+
HLA
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DR
+/
‑
具有MDSCs所有表征，定义为蜕膜MDSCs。蜕膜MDSCs作为蜕膜免疫细胞的组成部分之一，对于维持母胎界面免疫耐受微环境和正常妊娠至关重要，其可以通过产生多种免疫调节分子抑制T细胞活化、诱导调节性T细胞分化、抑制NK细胞杀伤活性等发挥其功能。对蜕膜MDSCs的研究有利于揭示其在维持母胎免疫耐受、促进胚胎发育中的作用机制，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人蜕膜MDSCs的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)蜕膜组织采集：在手术室无菌条件下获取蜕膜组织，经无菌生理盐水清洗组织上的血液后放入1640培养液中，冰上保存，2～3小时内送至实验室；(2)蜕膜组织进一步清洗：在超净工作台中，将蜕膜组织放于含有磷酸盐缓冲液的平皿中，用无菌镊子去掉淤血及混杂的绒毛组织，并用磷酸盐缓冲液冲洗3～4次；(3)剪碎：将蜕膜组织移入新的无菌平皿中，用移液器吸走多余缓冲液，用无菌剪刀剪至0.2
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0.5cm3微小颗粒；(4)消化：将剪碎的组织移入离心管中，加入1640培养液，向离心管中加入IV型胶原酶和I型DNA酶，放入37℃转速为120～150rpm的摇床中消化1～1.5小时；(5)终止消化、过滤：消化结束后加入等体积的磷酸盐缓冲液，使用细胞筛网过滤去掉未消化的组织，离心去上清；(6)单个核细胞获得：使用磷酸盐缓冲液重悬细胞，缓慢加入含有等体积Ficoll溶液的离心管中，使之形成两层；离心取中间白膜层，加入到新的离心管中，加满磷酸盐缓冲液并混匀，离心去上清；(7)细胞贴壁：使用1640培养液重悬细胞，使用台盼蓝拒染法计数，将细胞以2
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107/mL的密度加入细胞培养皿中，放置于37℃、5％CO2培养箱中培养1小时；(8)收集未贴壁细胞：收集悬浮细胞，并用磷酸盐缓冲液冲洗培养皿收集贴壁不牢固的细胞，离心去上清；(9)MDSCs分离：使用分选液重悬细胞，调整细胞浓度至1
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108/mL，按100uL/mL加入STEMCELL CD33磁珠，室温孵育10～20min,按100uL/mL加入RapidSpheres，混匀室温孵育10～20min；加入分选液至2.5mL，将管置于磁体中，室温10～15min，将磁体和管一同倒置，弃掉液体；加入分选液至2.5mL，混匀室温孵育15～20min，将磁体和管一同倒置，弃掉液体；加入磷酸盐缓冲液并混匀，离心去上清；(10)流式检测：收集细胞，调整细胞浓度至1
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108/mL，使每管的细胞为1
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【专利技术属性】
技术研发人员：胡雪梅，戚厚宝，李元焘，王玉，
申请(专利权)人：滨州医学院，
类型：发明
国别省市：