产漆酶高效降解黄曲霉毒素B1菌株的筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种产漆酶高效降解黄曲霉毒素B1菌株的筛选方法。所述方法使用香豆素

【技术实现步骤摘要】
产漆酶高效降解黄曲霉毒素B1菌株的筛选方法


[0001]本专利技术属于微生物
，涉及一种产漆酶高效降解黄曲霉毒素B1菌株的筛选 方法。

技术介绍

[0002]黄曲霉毒素B1(AFB1)是目前已知的致癌性和毒性最强的化学物质之一，它广泛 分布于含油脂的食物中，理化性质极其稳定，被世界卫生组织划分ⅠA级致癌物质。微 生物脱毒法由于安全、高效、低成本等特点被广泛关注。微生物脱除AFB1主要基于两 种途径，一是益生菌菌体吸附；二是利用微生物的代谢产物破坏毒素结构，将其分解为 无毒产物。目前报道的能够降解黄曲霉毒素的微生物有橙色黄杆菌、分支杆菌、放线菌、 担子菌等。这些微生物中有一部分，如铜绿假单胞菌为致病菌，或者其降解活性物质存 在安全性问题，大部分筛得的菌株都难以应用于实际。
[0003]目前筛选黄曲霉毒素降解菌的方法主要为：将菌液接种于香豆素平板，选取生长良 好的菌落，1)连续取样划线进行初步筛选(食品工业科技2017 38(20):120-124.)；2) 接种于36接种器，挑取有生长现象的菌落，进行连续划线培养(中国农业科学2008 41(5):1459-1463.)。这些筛选方法不仅前期工作量巨大，筛到的菌株混乱复杂，可能得 到无法使用的致病菌，且活性成分的未知导致其后期提取、纯化与应用耗时、耗力，最 终可能出现降解活性成分难以纯化或实用性、安全性较差的结果。
[0004]漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，主要分布于细菌和大型真菌中，能催化氧化多种酚 类和非酚类化合物，也能氧化黄曲霉毒素，是一种环境友好型酵素。在纸浆废水处理、 土壤的生物修复、食品中酚类化合物的生物脱毒等领域有重要潜在应用价值而被广泛关 注。传统产漆酶菌株的筛选方法主要为：将菌液接种于愈创木酚-木质素降解选择培养 基，选择产生红棕色氧化带的菌落，王会娟用这种方法筛选到8株高产漆酶的平菇菌株， 但经过降解测试，发现其中仅有两株拥有较高的AFB1降解能力(核农学报2012 26(7):1025-1030.)。该方法仍然无法确定平板上菌株的AFB1降解能力，这加大了筛选的 工作量。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种产漆酶高效降解黄曲霉毒素B1菌株的筛选方法。该筛 选方法具有简便、高效且成本低的特点，通过该筛选方法能够减少整个筛选周期的工作 量，直接得到产漆酶降解黄曲霉毒素B1高效菌株，后期可以根据漆酶酶活纯化活性物 质，漆酶应用于食品中的安全性也有一定保障，大大提高筛选效率。
[0006]实现本专利技术目的的技术方案如下：
[0007]产漆酶高效降解黄曲霉毒素B1菌株的筛选方法，为保证所筛选菌株可以代谢产生 漆酶高效降解AFB1，在筛选平板中加入显色剂愈创木酚，其遇到漆酶会产生红棕色氧 化带。同时，选取AFB1的结构相似物香豆素作为初筛平板中的唯一碳源，可以在平板 上生长良好即说明菌株能够有效利用香豆素，综合来说，在香豆素-宇愈创木酚初筛平 板上生长
明，并非用于限定本专利技术应用的范围。
[0026]实施例1
[0027]为了提高筛选到高效产漆酶降解AFB1的效果，在本实施例中，筛菌原材料取自毒 素污染严重地区的土壤、树木、可食用真菌。土壤是微生物富集的物种库，树木和可食 用真菌中富含漆酶产生菌，毒素污染环境中更容易出现降解能力优良的菌株，为此类筛 菌工作提供了极大的可行性。
[0028]1)培养基制备：
[0029]PDB培养基：土豆200g煮成汁纱布过滤，葡萄糖20g，加水定容至1000mL，pH 自然，121℃高温灭菌20min。
[0030]香豆素-愈创木酚初筛平板：(NH4)2SO
4 5.00g，MgSO4·
7H2O 2.15g，KH2PO
4 2.55g， CaCl2·
2H2O 0.15g，Na2HPO4·
12H2O 0.45g，CuSO4·
5H2O 0.50g，琼脂粉20g，纯水1000 mL，pH 6.5，121℃高温灭菌20min后加入1g香豆素、400μL愈创木酚。
[0031]2)取样：从南京市、昆明市不同区域采集土层深度5cm～15cm处湿润的土壤样品 10份，每份100g；可食用真菌平菇、口菇、杏鲍菇、金针菇、香菇、木耳各3份，每 份100g；水杉、梧桐、桂花树树皮各5g。
[0032]3)菌株初筛：每个土样取10g样本于无菌锥形瓶中，加入100mL无菌水与一定玻 璃珠，37℃摇床震荡2h。取悬浊液以10％接种量接种至PDB培养基，37℃、200rpm 摇床培养2d。2d后取培养液用pH为7.4的无菌PBS对培养液进行10-2
、10-3
、10-4
的 梯度稀释，稀释液分别取100μL涂布于香豆素-愈创木酚初筛平板，37℃培养5d。可食 用真菌和树皮使用打孔器制成直径5mm，厚1mm的圆片，于75％的酒精中浸泡10min 后接种于香豆素-愈创木酚初筛平板，选取平板上生长良好且周围有明显红棕色氧化带 的菌落，连续3次划线于初筛平板，同时逐步提高平板中香豆素的浓度分别为1.5g/L、 2.0g/L、2.5g/L，对菌株进行纯化和驯服，并保存菌株。
[0033]4)菌株复筛：将纯化的菌株接种于PDB培养基，37℃，200rpm摇床培养5d得 到发酵菌液。可食用真菌取子实体10g，加入40mL预冷过的pH为7.4的无菌PBS， 榨汁机充分破壁，匀浆于25℃，200rpm摇床提取1h，使用无菌纱布过滤得提取液。 测量其漆酶酶活及AFB1降解率。
[0034]漆酶活力测定及酶活力定义：柠檬酸缓冲液(pH3.6)和ABTS工作液(1mmol/L) 30℃孵育10min，200μL反应体系中，加入缓冲液100uL、底物1mmol/LABTS 50μL, 粗酶液(空白)50μL,以1min内催化氧化1μmol/L ABTS的酶量为1个酶活单位 (IU)。30℃酶标仪孵育3min，间隔10s中等速度震动一次，测OD
420
。
[0035]漆酶酶活计算公式如下：A＝106×
V
总
×
(OD
样品-OD
空白
)/(ε
×
V
酶
×
t)
[0036]其中ε为420nm处ABTS的摩尔消光系数，3.6
×
104mol/L-1
cm-1
；V
总
＝200μL；V 酶
＝50μL。漆酶活力单位为U/L。
[0037]AFB1降解能力测试：取800μL发酵菌液或提取液于2mL EP管中，加入200μL 浓度为500μg/L AFB1溶液(AFB1终浓度为100μg/L)，37℃，200rpm摇床避光孵育3d。 5000rpm离心15min，用黄曲霉毒素B1定量检测试剂盒测量上清中AFB1的残留量，空 白对照为800μL培养基加入200μL AFB1溶液混合。
[00本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.产漆酶高效降解黄曲霉毒素B1菌株的筛选方法，其特征在于，具体步骤如下：步骤1，取土壤样本，将其加入至无菌水中，分散均匀得到悬浊液，取悬浊液接种于PDB培养基中，37℃下摇床培养得到富集液；取可食用真菌或树木样本，制成圆片，75％酒精浸泡清洗；步骤2，取富集液梯度稀释后涂布于香豆素-愈创木酚初筛平板，或将树木样本或可食用真菌圆片接入香豆素-愈创木酚初筛平板上，37℃培养3～6d，选择平板上生长良好、且周围有红棕色氧化带的菌落，继续划线3次分离，并逐步梯度提高初筛平板中香豆素的浓度，纯化并保存菌株，所述的香豆素-愈创木酚初筛平板的配方为(NH4)2SO
4 5.00g，MgSO4·
7H2O 2.15g，KH2PO
4 2.55g，CaCl2·
2H2O 0.15g，Na2HPO4·
12H2O 0.45g，C...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋玉，石若夫，
申请(专利权)人：南京理工大学，
类型：发明
国别省市：