一种淋巴细胞染色体核型制片方法技术

本发明专利技术公开了一种淋巴细胞染色体核型制片方法，通过在新鲜采集的血样中添加抗凝剂，接种培养后制备单细胞悬液，利用低渗液进行低渗处理，再通过核型固定液固定制片，所述的抗凝剂肝素钠和纤溶酶组成，所述的低渗液为丙三醇和KCl混合溶液，所述的核型固定液卡诺氏固定液的中添加二甲基亚砜形成。该方法通过抗凝剂和低渗液的作用提升淋巴细胞的分散程度及舒展性，固定液的快速固定作用提升染色效果，最终实现了显带条纹清晰，易于辨认的特点。易于辨认的特点。易于辨认的特点。

【技术实现步骤摘要】
一种淋巴细胞染色体核型制片方法


[0001]本专利技术属于生物
，涉及细胞核型分析，特别是一种淋巴细胞染色体核型制片方法。

技术介绍

[0002]染色体是细胞核中的遗传物质，血液中的淋巴细胞在一定条件下培养后，经收获、制片、胰酶消化后染色显带，可在显微镜下观察到染色体，人类有23对染色体，其中22对为常染色体，1对为决定男女性别的性染色体，染色体上载有遗传信息的基因，染色体数目增加或减少，或染色体有缺失、易位等结构异常称染色体病，可出现相应的临床症状。染色体核型分析技术是以分裂中期染色体为研究对象，根据染色体的长度、着丝点位置、长短臂比例、随体的有无等特征，并借助显带技术对染色体进行分析、比较、排序和编号，根据染色体结构和数目的变异情况来进行诊断。核型分析可以为细胞遗传分类、物种间亲缘的关系以及染色体数目和结构变异的研究提供重要依据。
[0003]目前的染色体核型分析技术主要包括细胞培养、收获、制片、显带和分析几个步骤，在此过程需要使用抗凝剂、抑制剂、低渗液、固定液和染料等试剂，由于外周血淋巴细胞样本之间存在差异，且使用的试剂种类繁多，各试剂之间或多或少都会存在相互影响，经常会出现有染色体在胞浆中无法逸出，核型偏小，染色体偏短、或染色体分散过度，无法准确计数核型，条带模糊不清，染色体的条带辨认困难等情况，导致核型分析失败，极大地影响了显带效率和分析质量。因此，染色体核型分析的准确性和成功率一直是本领域研究人员不断探索的方向。

技术实现思路

[0004]为了克服现有核型分析的试剂体系不稳定导致的条带模糊不清等缺陷，提高分析结果的准确性，在本专利技术中提供了一种淋巴细胞染色体核型制片方法，通过抗凝剂和低渗液的作用提升淋巴细胞的分散程度及舒展性，固定液的快速固定作用提升染色效果，最终实现了显带条纹清晰，易于辨认的特点。
[0005]为了实现上述技术效果，本专利技术具体采用以下技术方案：
[0006]一种淋巴细胞染色体核型制片方法，通过在新鲜采集的血样中添加抗凝剂，接种培养后制备单细胞悬液，利用低渗液进行低渗处理，再通过核型固定液固定制片，所述的抗凝剂肝素钠和纤溶酶组成，所述的低渗液为丙三醇和KCl混合溶液，所述的核型固定液为在卡诺氏固定液中添加二甲基亚砜形成。
[0007]进一步的，所述肝素钠的添加量为10～20IU/mL，所述纤溶酶的添加量为0.1～0.5IU/mL。
[0008]所述肝素钠用于干扰血液样本的凝血过程，在体内外都有抗凝血作用。通过与抗凝血酶Ⅲ(AT
‑Ⅲ
)结合，而增强后者对活化的Ⅱ、
Ⅸ
、X、
Ⅺ
和
Ⅻ
凝血因子的抑制作用，阻止血小板凝集和破坏、妨碍凝血激活酶的形成、阻止凝血酶原变为凝血酶，抑制凝血酶，从而妨
碍纤维蛋白原变成纤维蛋白，从而发挥抗凝作用。
[0009]所述纤溶酶具有纤维蛋白溶解活性，能够消化纤维蛋白、纤维蛋白原和V因子、VIII因子及XII因子，纤维蛋白溶解能够缓慢清除凝血块，降低血小板聚集及血液粘稠度，且降解得到的降解产物(FDP)具有抗凝作用。
[0010]所述纤溶酶与所述肝素钠配合使用从抗凝和降解两方面共同作用，不仅具有阻凝作用，还具有将凝结的血栓溶解的作用，提高了血样中淋巴细胞的分散性。
[0011]进一步的，所述丙三醇体积浓度为3％～8％，所述KCl浓度为0.05～0.1mol/Lmol/L。
[0012]所述KCl溶液可凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，结合丙三醇易于穿透细胞的能力，可与氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。一方面加快了低渗透过程，另一方面保证了细胞成分的构型，提高了黏附于染色体的核仁物质的分散性，使得在一个平面上观察所有得染色体形态，得到的染色体轮廓清楚，用于显带染色时能充分显示带型特点。
[0013]进一步的，所述二甲基亚砜占核型固定液的体积浓度为1％～10％。
[0014]所述二甲基亚砜可以增强卡诺氏固定液的渗透能力，使得核型固定液可以迅速进入组织中，从而对细胞的蛋白质成分进行改性，维持染色体的形态，以提高对显带判断的准确性。而且二甲基亚砜具有防冻保护能力，在卡诺氏固定液中冰醋酸在温度稍变低时即可形成冰晶，容易造成染色体发脆后丢失，通过与二甲基亚砜混合，可以防止冰醋酸结冰从而保护染色体的完整形态，避免结冰过程中造成染色体的断裂。
[0015]进一步的，所述外周血淋巴细胞染色体核型制片方法包括：
[0016]在采集的外周静脉血样中加入抗凝剂，接种至培养基上培养；
[0017]培养终止前加入秋水仙素，使血样中淋巴细胞停止于有丝分裂中期；
[0018]收集细胞培养液，离心去上清；
[0019]收集细胞沉淀加入预热的低渗液滴管吹打均匀，低渗处理完成后离心取细胞沉淀；
[0020]在细胞沉淀中加入核型固定液，滴管吹匀固定，离心去上清；重复固定多次；
[0021]根据细胞沉淀的多少加入核型固定液，吹打细胞制成微白色悬液；
[0022]用滴管吸取细胞悬液，于载玻片垂直上方滴片，烘干。
[0023]进一步的，所述秋水仙素处理时间为2～4h。细胞在分裂间期染色质凝集，为了方便检测核型，需要使细胞处于分裂间期。秋水仙素可以使细胞停滞于有丝分裂中期，但并不是阻滞时间越长越好，时间太长或者太短都会影响染色体中期的数目和形态，时间过长会解离过度不利于染色，而且会造成染色体断裂。
[0024]进一步的，所述低渗液处理温度为37℃，处理时间5～10min。低渗处理过程中时间太短处理不充分，细胞膨胀不充分，影响最后染色体的平铺，低渗处理时间过长，会使细胞提前破裂，致使染色体在散落于溶液中，降低检测准确度。
[0025]进一步的，所述固定液在使用前在室温条件下进行预处理。在该温度环境下可以加快分子运动，影响膜的流动性，降低膜的稳定性，从而影响膜的通透性增强细胞的通透性，增强固定液的固定效果。
[0026]本专利技术的有益效果为：
[0027]1)本专利技术通过在抗凝剂中使用纤溶酶，可以对凝结的血块进行溶解，而且溶解后的降解产物具有抗凝作用，配合肝素钠的抗凝作用，从抗凝和溶解两个方面阻止血样凝结，对保持淋巴细胞的分散性具有优良的作用，避免了血样从采集至检测之间的时间过长造成血样分散性下降导致的检测结果不准确。
[0028]2)通过混合低渗液的使用，一方面通过丙三醇的渗透能力缩短了细胞低渗处理的时间。另一方面通过丙三醇的保护作用稳定了细胞成分的构型。提高了细胞核仁物质的分散性，使得显色条带清楚，易于辨认，提高检测准确度。
[0029]3)利用二甲基亚砜提高了固定液的渗透能力，增强了固定液对细胞蛋白成分的固型作用，缩短固定处理时间，同时具有保护染色体的作用，避免了冰醋酸结冰对染色体的破坏。
[0030]综上，本专利技术通过抗凝处理、低渗处理和固定处理三个方面，提高了细胞染色体的分散性和舒展性，以及固型效果，共同提高了细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种淋巴细胞染色体核型制片方法，其特征在于，包括：在新鲜采集的血样中添加抗凝剂，所述抗凝剂由肝素钠和纤溶酶组成；将含有抗凝剂的所述血样接种培养；利用低渗液处理所述血样接种培养的培养液，所述低渗液为丙三醇和KCl混合溶液；将经所述低渗液处理的细胞沉淀用核型固定液固定制片，所述核型固定液为在卡诺氏固定液中添加二甲基亚砜形成。2.根据权利要求1所述的一种淋巴细胞染色体核型制片方法，其特征在于，所述肝素钠的添加量为10～20IU/mL，所述纤溶酶的添加量为0.1～0.5IU/mL。3.根据权利要求1所述的一种淋巴细胞染色体核型制片方法，其特征在于，所述丙三醇体积浓度为3％～8％，所述KCl浓度为0.05～0.1mol/L。4.根据权利要求1所述的一种淋巴细胞染色体核型制片方法，其特征在于，所述述二甲基亚砜占核型固定液的体积浓度为1％～10％。5.根据权利要求1～4中任一项所...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄静，冯丹丹，谷雷，
申请(专利权)人：河南科技大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：