一种基于电穿孔的细胞膜包覆磁珠垂钓中药活性成分的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种基于电穿孔的细胞膜包覆磁珠垂钓中药活性成分的方法，该方法包括：一、采用包覆和修饰合成Fe3O4@BSA

【技术实现步骤摘要】
一种基于电穿孔的细胞膜包覆磁珠垂钓中药活性成分的方法及其应用


[0001]本专利技术属于中药活性成分筛选
，具体涉及一种基于电穿孔的细胞膜包覆磁珠垂钓中药活性成分的方法及其应用。

技术介绍

[0002]传统中药活性成分研究通常采用生物效应导向的系统分离结合药理实验确定。中药成分复杂，并且有效成分含量往往低微，因此其分离分析操作烦琐，工作量大，周期长，成功率低，而且分解和忽视了中药“多组分
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多靶点”整体作用的本质。
[0003]寻找活性成分快速筛选方法和技术一直是国内外制药公司关注的焦点。迄今为止，已明确的药物靶标超过500个，其中超过50%的药物以膜受体为靶标。因此，以膜受体靶标为核心的药物直接筛选已成为发现先导化合物的有效方法。近年来，以磁性纳米微球为载体，使用细胞膜囊泡作为功能涂层，制备细胞膜功能化磁性纳米微球，在外加磁场的定向控制下，利用其磁响应性和膜表面亲和基团高选择性，从复杂的生物体系中“垂钓”出活性物质，已成功用于中药中细胞膜结合活性成分的筛选。然而，膜受体包覆磁珠的制备是制约该技术发展的瓶颈。
[0004]传统的细胞膜包覆磁性纳米微球的方法需要通过两步实现：第一步是超声破碎细胞，制备细胞膜碎片；第二步是机械搅拌或超声作用下磁性纳米微球与细胞膜碎片充分混合后静置，通过磁性微球物理吸附细胞膜的磷脂双分子层，进而在其表面形成均匀的细胞膜层。尽管传统的方法可以有效地将细胞膜包覆于磁性纳米微球表面，然而仍然面临以下两方面问题：一是超声处理/机械力作用破坏了细胞膜的完整性，降低了细胞膜的功能，从而可能导致膜蛋白构象的改变甚至变性，降低药物筛选结果的准确性；二是这种物理吸附过程由于无法区分细胞膜内/外表面，导致药物筛选位点不明确，同时由于细胞膜内/外表面受体同时存在，单位面积药物筛选位点减少，降低了相关筛选方法的灵敏度。这些问题限制了细胞膜包覆磁珠垂钓方法的进一步开发和应用。由于细胞膜外表面含有大量药物靶点的配体结合域，因此，建立一种外表面朝外的完整细胞膜包覆纳米磁珠垂钓中药活性成分的方法具有重要意义。
[0005]细胞膜电穿孔技术（Electroporation）是在短时外加电场的作用下，细胞膜出现暂时微孔，通透性增大的物理过程。该过程使得一些原本无法穿过细胞膜的分子可以自由地进出细胞，电场取消后微孔关闭而不会对细胞造成任何影响，这一特性使得电穿孔技术目前广泛用于基因转染和膜伪装纳米递药体系的构建，在细胞膜垂钓中药活性成分研究领域暂时还未广泛涉及。
[0006]类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis, RA）是临床常见的一种以侵蚀性关节炎为主要症状，多种靶细胞参与的自身免疫性疾病。巨噬细胞因分泌促炎因子、趋化因子及组织降解酶等具有多方面作用而处于类风湿关节炎免疫细胞的核心地位。巨噬细胞已成为类风湿性关节炎治疗的重要靶细胞，其膜上受体是抗类风湿性关节炎活性物质发挥作用的
重要靶点。附子能温补肾阳、祛风散寒，具有抗炎、镇痛等药理活性，临床上用于治疗关节炎，然而其抗炎活性成分仍不清楚。

技术实现思路

[0007]本专利技术所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种基于电穿孔的细胞膜包覆磁珠垂钓中药活性成分的方法。该方法制备生物相容性好兼具膜靶向的Fe3O4@BSA
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RGD磁性纳米颗粒，然后与靶细胞巨噬细胞共培养后进行电穿孔，从而构建完整巨噬细胞膜包覆纳米磁珠体系并对中药活性成分垂钓筛选，保证了体系中细胞膜的结构完整性和外表面朝外，相对传统包覆方法不区分膜外/内表面朝向，相对增加垂钓载体表面靶点数量，提高了对中药活性成分筛选的准确性和灵敏度。
[0008]为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：一种基于电穿孔的细胞膜包覆磁珠垂钓中药活性成分的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：步骤一、Fe3O4@BSA
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RDG磁性纳米颗粒的合成步骤101、Fe3O4磁性纳米颗粒的合成：在全程氮气保护下，首先将乙酰丙酮铁在磁力搅拌下溶解于油胺与油酸的混合溶液中，得到乙酰丙酮铁溶液，然后将N
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甲基吡咯烷酮在机械搅拌下加热回流，再将乙酰丙酮铁溶液逐滴加入到加热回流后的N
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甲基吡咯烷酮中进行反应，冷却至室温后经磁分离、洗涤，得到Fe3O4磁性纳米颗粒；步骤102、Fe3O4@BSA磁性纳米颗粒的合成：将牛血清白蛋白和1
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(3
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二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐在室温下搅拌得到BSA溶液，然后将步骤101中得到的Fe3O4磁性纳米颗粒加入到BSA溶液中继续搅拌反应，再依次经磁分离、洗涤和冷冻干燥，得到牛血清白蛋白包覆的Fe3O4磁性纳米颗粒即Fe3O4@BSA磁性纳米颗粒；步骤103、Fe3O4@BSA
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RGD磁性纳米颗粒的合成：将步骤102中得到的Fe3O4@BSA磁性纳米颗粒分散在去离子水中，并加入PBS超声分散，得到Fe3O4@BSA磁性纳米颗粒分散液，然后将1
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(3
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二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐加入到Fe3O4@BSA磁性纳米颗粒分散液中在避光条件下搅拌，继续加入N
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羟基琥珀酰亚胺在避光条件下搅拌，再加入RGD在室温避光条件下搅拌进行反应，经磁分离、洗涤，得到RGD修饰的Fe3O4@BSA磁性纳米颗粒即Fe3O4@BSA
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RGD磁性纳米颗粒；步骤二、完整巨噬细胞膜包覆纳米磁珠的制备步骤201、将巨噬细胞接种于DMEM培养基中，放入恒温培养箱中培养至细胞密度为70%~80%，弃去培养液后加入到含有步骤一中Fe3O4@BSA
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RGD磁性纳米颗粒的培养基中进行共培养，得到共培养液；步骤202、采用胰酶消化步骤201中得到的共培养液，经磁分离收集负载Fe3O4@BSA
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RGD磁性纳米颗粒的细胞，将负载Fe3O4@BSA
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RGD磁性纳米颗粒的细胞重悬于含有Fe3O4@BSA
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RGD磁性纳米颗粒的培养基中得到细胞混悬液，然后将细胞混悬液吸入到电穿孔比色皿中并置于冰块上孵育，再采用电穿孔仪进行电穿孔，并立即转入冰浴中，加入预热的培养基后放入培养箱中进行培养，经DMEM培养基洗涤后，得到负载Fe3O4@BSA
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RGD磁性纳米颗粒的巨噬细胞，即完整巨噬细胞膜包覆纳米磁珠RAW
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Fe3O4@BSA
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RDG；步骤三、垂钓中药活性成分步骤301、制备中药提取物；
步骤302、将步骤二中制备的巨噬细胞膜包覆纳米磁珠悬浮后得到悬浮液，然后将步骤301中制备的中药提取物加入到悬浮液中，并放入培养箱中进行培养，再将培养液经磁力固液分离获得沉淀，沉淀经缓冲液冲洗后采用有机溶剂振摇洗脱，经磁力固液分离得到含有中药活性成分的垂钓液。
[0009]本专利技术先制备Fe3O4磁性本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于电穿孔的细胞膜包覆磁珠垂钓中药活性成分的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：步骤一、Fe3O4@BSA
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RDG磁性纳米颗粒的合成步骤101、Fe3O4磁性纳米颗粒的合成：在全程氮气保护下，首先将乙酰丙酮铁在磁力搅拌下溶解于油胺与油酸的混合溶液中，得到乙酰丙酮铁溶液，然后将N
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甲基吡咯烷酮在机械搅拌下加热回流，再将乙酰丙酮铁溶液逐滴加入到加热回流后的N
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甲基吡咯烷酮中进行反应，冷却至室温后经磁分离、洗涤，得到Fe3O4磁性纳米颗粒；步骤102、Fe3O4@BSA磁性纳米颗粒的合成：将牛血清白蛋白和1
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二甲氨基丙基)
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乙基碳二亚胺盐酸盐在室温下搅拌得到BSA溶液，然后将步骤101中得到的Fe3O4磁性纳米颗粒加入到BSA溶液中继续搅拌反应，再依次经磁分离、洗涤和冷冻干燥，得到牛血清白蛋白包覆的Fe3O4磁性纳米颗粒即Fe3O4@BSA磁性纳米颗粒；步骤103、Fe3O4@BSA
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RGD磁性纳米颗粒的合成：将步骤102中得到的Fe3O4@BSA磁性纳米颗粒分散在去离子水中，并加入PBS超声分散，得到Fe3O4@BSA磁性纳米颗粒分散液，然后将1
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二甲氨基丙基)
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乙基碳二亚胺盐酸盐加入到Fe3O4@BSA磁性纳米颗粒分散液中在避光条件下搅拌，继续加入N
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羟基琥珀酰亚胺在避光条件下搅拌，再加入RGD在室温避光条件下搅拌进行反应，经磁分离、洗涤，得到RGD修饰的Fe3O4@BSA磁性纳米颗粒即Fe3O4@BSA
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RGD磁性纳米颗粒；步骤二、完整巨噬细胞膜包覆纳米磁珠的制备步骤201、将巨噬细胞接种于DMEM培养基中，放入恒温培养箱中培养至细胞密度为70％～80％，弃去培养液后加入到含有步骤一中Fe3O4@BSA
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RGD磁性纳米颗粒的培养基中进行共培养，得到共培养液；步骤202、采用胰酶消化步骤201中得到的共培养液，经磁分离收集负载Fe3O4@BSA
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RGD磁性纳米颗粒的细胞，将负载Fe3O4@BSA
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RGD磁性纳米颗粒的细胞重悬于含有Fe3O4@BSA
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RGD磁性纳米颗粒的培养基中得到细胞混悬液，然后将细胞混悬液吸入到电穿孔比色皿中并置于冰块上孵育，再采用电穿孔仪进行电穿孔，并立即转入冰浴中，加入预热的培养基后放入培养箱中进行培养，经DMEM培养基洗涤后，得到负载Fe3O4@BSA
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RGD磁性纳米颗粒的巨噬细胞，即完整巨噬细胞膜包覆纳米磁珠RAW
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Fe3O4@BSA
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RDG；步骤三、垂钓中药活性成分步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：张雅，谭光国，周倩，廖文婷，王超丽，
申请(专利权)人：中国人民解放军空军军医大学，
类型：发明
国别省市：