一种利用CUT&Tag技术鉴定植物中转录因子与染色质互作的试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种利用CUT&Tag技术鉴定植物中转录因子与染色质互作的试剂盒及方法，该试剂盒包括：生物素化的Tn5转座酶、细胞核提取液、抗体杂交液、链霉亲和素洗涤液、DNA洗脱液、一抗、二抗、DNA纯化磁珠、链霉亲和素磁珠、蛋白酶抑制剂、毛地黄皂苷溶液、Triton X

【技术实现步骤摘要】
一种利用CUT＆Tag技术鉴定植物中转录因子与染色质互作的试剂盒及方法


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种利用CUT&Tag技术鉴定植物中转录因 子与染色质互作的试剂盒及方法。

技术介绍

[0002]基因表达调控在多细胞生物的生长和发育中起关键作用。在多细胞生物中，所有 细胞都具有相同的基因组序列。但是，基因组调控，包括DNA甲基化、组蛋白修饰、 转录因子及其募集的蛋白质复合物的差异结合，导致不同组织和不同发育时期的基因 表达差异。
[0003]染色质免疫沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)是一种广泛使用的染色质 分析方法，是用于全基因组DNA
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蛋白质相互作用的研究的金标准。ChIP实验的原理 是将目的蛋白和DNA的结合用甲醛固定，然后将染色质复合通过机械超声或者酶切 的方式片段化，随后进行基于抗体与靶标蛋白的免疫共沉淀富集作用，从而将与靶标 蛋白互作的染色质片段同时富集下来，进一步地，富集的染色质片段可以用于后续的 高通量测序研究全基因范围内的结合表征，或者用于荧光定量PCR(qPCR)实验验证转 录因子与特殊DNA候选位点的结合状况。
[0004]2019年，西雅图佛瑞德哈金森癌症研究中心开发的CUT&Tag(Cleavage UnderTargets and Tagmentation,CUT&Tag)技术是一种研究表观基因组染色质分析策略的新 技术。其原理与ChIP存在本质的差异。从原理上看，CUT&Tag是一项酶栓系 (enzyme
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tethering)策略，它首先利用抗体在完整的细胞或者细胞核内识别靶标蛋白， 随后加入Protein A/G融合的Tn5转座酶识别与靶标蛋白结合的抗体，因此，Tn5转座 酶被栓系在靶标蛋白及其结合的染色质附近，在镁离子的作用下，Tn5转座酶对临近 的染色质进行切割并加入DNA接头，产生的靶标片段用于后续建库和高通量测序。
[0005]CUT&Tag的功能与常规ChIP技术相同，却有其独特的优势：1)由于原位激活转 座酶而产生的高分辨率和低背景信号；2)因为不需要DNA超声处理片段化染色质， 建库过程不需要加接头，大大简化了实验操作和建库流程，节省了实验时间；3)由于 该过程的高灵敏度，因此只需少量起始原料。
[0006]CUT&Tag技术是一个全新的技术，仍然在迅速的发展完善过程中。CUT&Tag技 术最初开发出来的时候被用于动物细胞染色质状态分析。目前CUT&Tag在组蛋白修 饰研究中的流程/方法已经在动物细胞和植物中都有具体的报道，甚至在动物中，利用 CUT&Tag进行组蛋白修饰的研究已经发展到了单细胞的水平。然而，由于植物具有 细胞壁组织及多种次生代谢产物的影响，针对特殊植物转录因子与染色质结合研究的 CUT&Tag流程仍然是个挑战。
[0007]首先，植物细胞存在细胞壁、大液泡和复杂次生代谢产物，限制了抗体和转座酶 进入到植物细胞内。目前已经有了先提取植物细胞的细胞核，利用细胞核进行 CUT&Tag反应的植物CUT&Tag实验的成功报道。然而，目前动植物中只有染色质存 在丰度较高的组蛋
白修饰H3K4me3和H3K27me3被成功鉴定，利用CUT&Tag鉴定 植物特异的转录因子与DNA的结合，目前还未见成功案例报道。这很可能是由于 CUT&Tag技术主打的可以使用低起始量的细胞的特点造成的。目前已有的纯化和建库 手段也是基于低细胞起始量的CUT&Tag反应。由于染色质的使用量不够(不如传统 的ChIP用量多)，造成低丰度的转录因子与DNA互作的鉴定灵敏度不高。而一旦加 大反应体系中染色质的使用量，过量的未剪切DNA又会影响后续的二代建库测序。 因此，如何建立一个适合植物转录因子，特别是低丰度转录因子研究的CUT&Tag流 程，是个极大的挑战。
[0008]ChIP实验与qPCR结合是鉴定转录因子与特定DNA区域结合的金标准。常规 CUT&Tag与传统ChIP相比存在重要缺陷，即无法进行像ChIP
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qPCR那样的后续荧光 定量PCR实验。这是因为，从原理上看，在CUT&Tag反应完成之后，未被剪切的(非 靶标)染色质仍然存在于体系中无法去除，无法区分总的input染色质和被片段化的靶 标染色质，从而无法进行后续qPCR实验。这个缺陷极大地限制了CUT&Tag在鉴定 转录因子特定几个预选的DNA结合位点时候的应用。可以想象，研究人员一方面采 用CUT&Tag结合高通量测序研究在全基因组范围内整体结合特征，却在额外再进行 传统的ChIP
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qPCR实验单独确定转录因子与几个感兴趣的基因位点的结合，这在实验 设计，实验操作和试剂耗材上是及其不科学和不合理的。
[0009]由于CUT&Tag的这些不足，目前市面上的基于CUT&Tag研究染色质状态的试剂 盒均为适合少量样本的试剂盒，也只局限于建库和进行高通量测序的操作，并且只较 好地适合少量动物细胞中的研究。至今，尚无完整的有效的植物转录因子的CUT&Tag 试剂盒。

技术实现思路

[0010]本专利技术要解决的技术问题是克服现有CUT&Tag技术在植物中应用的缺陷和不足， 提供一种在动植物、特别是丰度较低的染色质结合蛋白(例如转录因子)与DNA的 互作研究中广泛适用的CUT&Tag
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seq和CUT&Tag
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qPCR策略及相应试剂盒，促进表 观遗传调控新技术新手段的发展。
[0011]具体技术方案如下：
[0012]本专利技术提供了一种利用CUT&Tag技术鉴定植物中转录因子与染色质互作的试剂 盒，其特征在于，包括：生物素化的Tn5转座酶、细胞核提取液、洗涤液、抗体杂交 液、链霉亲和素洗涤液、DNA洗脱液、一抗、二抗、DNA纯化磁珠、链霉亲和素磁 珠、蛋白酶抑制剂、毛地黄皂苷溶液、乙二胺四乙酸溶液、氯化钠溶液、氯化镁溶液、 Triton X
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100溶液、十二烷基硫酸钠溶液、甘氨酸溶液、预装的Phase Lock Gel凝胶、 DNA共沉淀剂和PCR反应液。
[0013]由于该试剂盒是由含有生物素标记接头序列的转座酶介导的，我们将之称为生物 素化的转座酶介导的CUT&Tag(Biotinylated Tn5 Transposase Mediated CUT&Tag,B
‑ꢀ
CUT&amp;Tag)。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用CUT&amp;Tag技术鉴定植物中转录因子与染色质互作的试剂盒，其特征在于，包括：生物素化的Tn5转座酶、细胞核提取液、洗涤液、抗体杂交液、链霉亲和素洗涤液、DNA洗脱液、一抗、二抗、DNA纯化磁珠、链霉亲和素磁珠、蛋白酶抑制剂、毛地黄皂苷溶液、乙二胺四乙酸溶液、氯化钠溶液、氯化镁溶液、Triton X
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100溶液、十二烷基硫酸钠溶液、甘氨酸溶液、预装的Phase Lock Gel凝胶、DNA共沉淀剂和PCR反应液。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述生物素化的转座酶由转座酶与生物素化的DNA接头引物孵育形成；所述生物素化的DNA接头引物由引物A与引物B退火形成的双链接头I和引物A与引物C退火形成的双链接头II构成；引物A包含转座酶识别的mosaic end(ME)序列片段，5
’
端磷酸化，3'端氨基(AminolinkerC7)修饰；引物B的3
’
端为与引物A反向互补的序列，5
’
端为测序接头序列；引物C的3
’
端为与引物A反向互补的序列，5
’
端为测序接头序列；引物B或引物C其中的一个的5
’
端标记有生物素三甘醇。3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述Tn5转座酶为pG
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Tn5转座酶或pA
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Tn5转座酶；细胞核提取液为含有0.5％
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1％体积浓度Triton X
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100的Tris缓冲液；洗涤液为含有蛋白酶抑制剂和毛地黄皂苷的Tris缓冲液；抗体杂交液为含有EDTA,BSA,蛋白酶抑制剂和毛地黄皂苷的Tris缓冲液；链霉亲和素洗涤液为含EDTA和Tween
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20的Tris缓冲液；DNA洗脱液为含醋酸钠和甲酰胺的溶液；DNA纯化磁珠为表面羧基化修饰的磁珠。4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括：引物I、引物II和PCR预混液；所述引物I的碱基序列如SEQ ID NO.4
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SEQ ID NO.15所示序列中的一种；所述引物II的碱基序列如SEQ ID NO.16
‑
SEQ ID NO.23所示序列中的一种。5.一种利用CUT&amp;Tag技术鉴定植物中转录因子与染色质互作的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)利用生物素化的DNA接头引物与Tn5转座酶孵育，组装形成生物素化的Tn5转座酶二聚体；(2)固定细胞核内转录因子与染色质的互作状态，提取待测植物组织的细胞核；(3)利用一抗和二抗识别细胞核内与染色质结合的转录因子，再利用生物素化的转座酶二聚体识别抗体所在区域并切割染色质，形成生物素标记的染色质片段；(4)利用植物基因组DNA提取液提取反应后的DNA，利用链霉亲和素磁珠对其中生物素标记的DNA片段进行纯化，形成链霉亲和素磁珠
‑
DNA片段混合物；(5)以链霉亲和素磁珠
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DNA片段为模板，进行PCR建库，建立转录因子与染色质互作的高通量测序文库；(6)文库质检、高通量测序及生物信息学分析；或者，(A)利用生物素化的DNA接头引物与Tn5转座酶孵育，组装形成生物素化的Tn5转座酶二聚体；(B)固定细胞核内转录因子与染色质的互作状态，提取待测植物组织的细胞核；(C)利用一抗和二抗识别细胞核内与染色质结合的转录因子，再利用生物素化的转座
酶二聚体识别抗体所在区域并切割染色质，形成生物素标记的染色质片段；(D)利用植物基因组DNA提取液提取反应后的DNA，取出一部分DNA溶液中DNA充作荧光定...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐盛春，陶晓园，徐飞，李素娟，王钢军，王剑，陈光，邵健丰，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：