一种基于人工核酶的食品中污染物多色荧光分析方法技术

本发明专利技术公开了一种基于人工核酶的食品中污染物多色荧光分析方法，属于分子生物学检测领域。本发明专利技术以金纳米颗粒为载体，合成AuNPs

【技术实现步骤摘要】
一种基于人工核酶的食品中污染物多色荧光分析方法


[0001]本专利技术涉及一种基于人工核酶的食品中污染物多色荧光分析方法，属于分子生物学检测领域。

技术介绍

[0002]近年来随着人们生活质量与观念水平的提高，牛奶已经逐渐成为家庭中的必需品，牛奶营养丰富，但有资料显示现代牛奶中抗生素、雌激素、微生物毒素含量增加，长时间摄入可能危害着人类健康尤其是对青少年生长发育和生殖系统有不利影响。因此，监测食品中污染物的含量对于确保食品安全至关重要。迄今为止，已经开发了多种分析检测方法用于联合检测食品中的污染物，包括仪器分析法和酶联免疫法(ELISA)。然而，这些方法可能预处理步骤繁琐、交叉反应较强等缺点。因此，有必要开发一种简单高效的多色荧光检测方法。
[0003]AuNPs
‑
DNA
‑
抗体是一种将纳米材料和免疫分析方法相结合的检测探针，其中抗体用于免疫竞争靶标，trigger DNA用于扩增信号。目前，该探针已被广泛应用到生物传感器领域。此外，很多基于DNAzyme的等温扩增技术也是近年来研究的热点。DNAzyme是一类具有催化功能的DNA分子。同蛋白质和RNA催化酶一样，DNAzyme能够催化多种类型的生化反应，并在不对称催化、生物传感器、DNA纳米技术以及临床诊断方面得到了广泛的应用。综上，结合AuNPs
‑
DNA
‑
抗体特异性检测探针与DNAzyme介导的核酸扩增(DANA)，根据检测探针设计的不同荧光素信号，实现食品中不同痕量污染物的高灵敏度检测分析。

技术实现思路

[0004][技术问题][0005]解决荧光免疫法同时检测多种污染物的问题，提供一种多色荧光高灵敏检测的便捷方法。
[0006][技术方案][0007]本专利技术的第一个目的是提供一种同时检测多种污染物的方法，所述方法的具体步骤为：
[0008](1)合成检测探针：在AuNPs表面修饰氯霉素(CAP)、雌二醇激素(17β
‑
E2)或黄曲霉毒素M1(AFM1)的引物DNA和相应的特异性抗体，分别得到针对CAP、17β
‑
E2、AFM1的三种检测探针；
[0009](2)将CAP、17β
‑
E2、AFM1相应抗原进行混合并添加至黑色聚苯乙烯微孔板，BSA封闭；
[0010](3)将步骤(1)制备的CAP、17β
‑
E2、AFM1的检测探针分别稀释后与待测样品混合后加入至步骤(2)中的黑色聚苯乙烯微孔板，孵育并清洗黑色聚苯乙烯微孔板；
[0011](4)将针对CAP、17β
‑
E2、AFM1的信号DNA和Mg
2+
分别加入至步骤(3)中的黑色聚苯乙烯微孔板，孵育并检测荧光强度信号。
[0012]在本专利技术的一种实施方式中，步骤(1)中合成检测探针的方法为：取一定量的AuNPs，加入CAP、17β
‑
E2或AFM1单克隆抗体，室温孵育，形成三种AuNPs
‑
抗体分散液；巯基修饰的CAP、17β
‑
E2或AFM1的引物DNA经TCEP活化后分别加入对应AuNPs
‑
抗体分散液，混匀并冷冻，溶解后加入PEG20000和PBS，获得AuNP
‑
DNA
‑
抗体分散液；加入BSA进行孵育，离心取上清获得检测探针。
[0013]在本专利技术的一种实施方式中，步骤(1)中合成检测探针的方法为：
[0014]a)取3mL含有13nm AuNPs的分散液，调节pH至8.5
‑
9，等分至3个离心管中，分别加入18μg CAP、17β
‑
E2或AFM1单克隆抗体，室温孵育1h，形成三种含AuNPs
‑
抗体的分散液；
[0015]b)巯基修饰的CAP的引物DNA、17β
‑
E2的引物DNA和AFM1的引物DNA经TCEP活化后(摩尔比1：100)分别加入对应AuNPs
‑
抗体分散液，置于
‑
20℃冷冻30min，溶解后加入30％PEG20000、0.1M PBS，持续混匀5min后，4℃条件下盐老化2h，形成含有AuNPs
‑
DNA
‑
抗体的分散液；
[0016]c)加入10％BSA，室温孵育40min，13000rpm离心15min，最终合成的探针分散于200μL 0.01M PBS中(含1％PEG20000和1％BSA，pH＝7.4)，4℃避光保存，一周内使用完。
[0017]在本专利技术的一种实施方式中，CAP的引物DNA的序列为：5
’‑
HS
‑
(T)
28
TCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGCGT
‑3’
。
[0018]在本专利技术的一种实施方式中，17β
‑
E2的引物DNA的序列为：5
’‑
HS
‑
(T)
28
GATTGTCTCCGAGCCGGTCGAAATGAAGCTA
‑3’
。
[0019]在本专利技术的一种实施方式中，AFM1的引物DNA的序列为：5
’‑
HS
‑
(T)
28
GCTACTCTCCGAGCCGGTCGAAATTAGAACG
‑3’
。
[0020]在本专利技术的一种实施方式中，CAP的信号DNA的序列为：5
’‑
FAM
‑
ACGCACTAT/rA/GGAAGAGAT
‑
BHQ1
‑3’
。
[0021]在本专利技术的一种实施方式中，17β
‑
E2的信号DNA的序列为：5
’‑
Cy3
‑
TAGCTTCAT/rA/GGACAATCA
‑
BHQ2
‑3’
。
[0022]在本专利技术的一种实施方式中，AFM1的信号DNA的序列为：5
’‑
Texas red
‑
CGTTCTAAT/rA/GGAGTAGCC
‑
BHQ2
‑3’
。
[0023]在本专利技术的一种实施方式中，步骤(2)中，将CAP、17β
‑
E2、AFM1相应抗原进行混合并添加至黑色聚苯乙烯微孔板，35～38℃下孵育1.5～2.5h，加入220μL 2％BSA在35～38℃下封闭0.5～1.5h。
[0024]在本专利技术的一种实施方式中，步骤(2)中，CAP、17β
‑
E2、AFM1相应抗原的添加浓度为0.6～1.5μg/mL。
[0025]在本专利技术的一种实施方式中，步骤本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种同时检测多种污染物的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤为：(1)合成检测探针：在AuNPs表面修饰氯霉素、雌二醇激素或黄曲霉毒素M1的引物DNA和相应的特异性抗体，分别得到针对氯霉素、雌二醇激素、黄曲霉毒素M1的三种检测探针；(2)将氯霉素、雌二醇激素、黄曲霉毒素M1相应抗原进行混合并添加至黑色聚苯乙烯微孔板，BSA封闭；(3)将步骤(1)制备的氯霉素、雌二醇激素、黄曲霉毒素M1的检测探针分别稀释后与待测样品混合后加入至步骤(2)中的黑色聚苯乙烯微孔板，孵育并清洗黑色聚苯乙烯微孔板；(4)将针对氯霉素、雌二醇激素、黄曲霉毒素M1的信号DNA和Mg
2+
分别加入至步骤(3)中的黑色聚苯乙烯微孔板，孵育并检测荧光强度信号。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，氯霉素的引物DNA的序列为：5
’‑
HS
‑
(T)
28
TCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGCGT
‑3’
；雌二醇激素的引物DNA的序列为：5
’‑
HS
‑
(T)
28
GATTGTCTCCGAGCCGGTCGAAATGAAGCTA
‑3’
；黄曲霉毒素M1的引物DNA的序列为：5
’‑
HS
‑
(T)
28
GCTACTCTCCGAGCCGGTCGAAATTAGAACG
‑3’
。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，氯霉素的信号DNA的序列为：5
’‑
FAM
‑
ACGCACTAT/rA/GGAAGAGAT
‑
BHQ1
‑3’
，雌二醇激素的信号DNA的序列为：5
’‑
Cy3
‑
TAGCTTCAT/rA/GGACAATCA
‑
BHQ2
‑3’
，黄曲霉毒素M1的信号DNA的序列为：5
’‑
Texas red
‑
CGTTCTAAT/rA/GGAGTAGCC
‑
BHQ2
‑3’
。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，将氯霉素、雌二醇激素、黄曲霉毒素M1...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭亚辉，沈维韦，桑潘婷，丁洪流，金萍，谢云飞，姚卫蓉，
申请(专利权)人：苏州市产品质量监督检验院，
类型：发明
国别省市：