一种新型体外培育牛黄电结石方法技术

本发明专利技术涉及中药原料药制备的技术领域，特别是涉及一种新型体外培育牛黄电结石方法，提供一种可以有效地提高胆汁酶促反应效率，缩短整体发酵时间，生产步骤简洁，提高牛黄体外凝结效率，降低能耗，安全性更高，得到的体外培育牛黄有效成分优于天然牛黄，达到中国药典2020年版对体外培育牛黄的要求；包括：S1胆汁处理；S2菌种繁殖：将大肠杆菌甘油菌种接种于扩增繁殖液体培养基中恒温培养6～7h；S3酶促反应：胆汁中加入发酵菌液水浴加热恒温震荡1～2h；S4灭菌处理；S5过滤沉淀；S6制备可聚沉胆汁胶体；S7凝结核准备：将牛黄颗粒插入针状银质电极负极，并浸泡至5％的稀盐酸中；S8牛黄电结石：将正负极同时插入至胆汁胶体中，控制牛黄颗粒缓慢转动；S9后处理。S9后处理。

【技术实现步骤摘要】
一种新型体外培育牛黄电结石方法


[0001]本专利技术涉及牛黄培育的
，特别是涉及一种新型体外培育牛黄电结石方法。

技术介绍

[0002]牛黄，即牛的胆结石，是中医常用细贵药材，具有清热解毒、清心豁痰、开窍凉肝、镇惊消肿、强心利胆等功用，我国许多名贵中成药，如：安宫牛黄丸、六神丸等均以牛黄为主药配制而成。现代医学研究表明，牛黄对于大脑皮层电信号紊乱产生的惊厥有明显抑制作用，且有显著的强心作用，能明显增强心肌收缩力，增加心率，是中药中罕见地具有急救功效的珍贵药材。但是天然牛黄的自然发生率仅约千分之一，因此牛黄药源匮乏，价格昂贵，国家药品监督管理部门现已批准体外培育牛黄作为天然牛黄的等效替代品，现在我国体外培育牛黄的生产工艺已经成熟，临床应用也已经积累了丰富经验，并且体外培育牛黄在外观、结构、成分、药效上与天然牛黄基本相同，根据指纹图谱的对比，体外培育牛黄的有效成分含量更高，均一性更优，现有的体外培育牛黄的技术线路主要有两条：
[0003]第一种路线为：公告号为CN102429927B和CN102512457B提供的专利中提出：使用大肠杆菌、变形杆菌或肠球菌的单一菌种或组合菌种，直接加入胆汁中进行数天的发酵，或者在培养基中进行扩增培养后，使用超声波震荡破损菌体，使菌体内部的β
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葡萄糖醛酸苷酶释放进入培养液，后加入胆汁中进行酶促反应，凝结时在胶体中加入酸性溶液作为促发剂，调节胆汁胶体PH值为弱酸性，打破胆汁胶体平衡状态，然后进行偏轴旋转，利用漩涡产生的向心力使悬浊颗粒向心聚集，从而产生牛黄凝结体。
[0004]该方法在胆汁发酵和酶促反应时间过长，并且由于偏轴旋转形成凝结核心难度较大，因此偏轴旋转凝结的速度缓慢，时间也较长，并且耗能较大，偏轴旋转凝结的效率很低。
[0005]第二种路线为：公告号为CN103690563B提供的专利中提出：通过使用活化壳聚糖作为螯合剂，将预制好的人造牛黄粉末喷涂螯合于牛黄成石核心上，不断喷涂聚集扩大，使之形成类似牛黄形态，该方法使得牛黄成型较为简单。
[0006]但是本方法中使用的壳聚糖等螯合剂本身并不是天然牛黄所应有的自然成分，牛黄产生药效是由包含多种微量成分参与复杂反应的结果，大量使用螯合剂将带来不确定的药理作用，壳聚糖、β
‑
环糊精、白蛋白等螯合剂的使用使得牛黄成型更容易，但是缺乏药理学的安全论证。

技术实现思路

[0007]为解决上述技术问题，本专利技术提供一种可以有效地提高胆汁酶促反应效率，缩短整体发酵时间，并且可以提高牛黄体外凝结效率，降低能耗，得到的体外培育牛黄有效成分与天然牛黄相似性的新型体外培育牛黄电结石方法。
[0008]本专利技术的一种新型体外培育牛黄电结石方法，包括以下步骤：
[0009]S1、胆汁处理：将新鲜牛胆汁使用400目无菌过滤网过滤去除残留肝胆组织，并将
过滤后的胆汁水浴加热至96～98℃，保持10min，然后降温至36～38℃备用；
[0010]S2、菌种繁殖：将大肠杆菌甘油菌种(ATCC25922)接种于扩增繁殖液体培养基(质量比为1：1：1的LB肉汤培养基、EC肉汤培养基和胰酪大豆胨液体培养基混合均匀而成)中，并在36～38℃下恒温培养6～7h，得到发酵菌液，其中含有大量的β
‑
葡萄糖醛酸苷酶；
[0011]S3、酶促反应：每1000ml处理后的胆汁中加入50ml富含β
‑
葡萄糖醛酸苷酶的发酵菌液，混合均匀后，在36～38℃下水浴加热恒温震荡1～2h，水浴震荡进行进行酶促反应；
[0012]S4、灭菌处理：将经过酶促反应后的胆汁水浴加热至96～98℃，维持30min，完成高温灭菌，并使残留的酶失活，得到免超声振荡的发酵灭菌胆汁；
[0013]S5、过滤沉淀：每1000ml灭菌胆汁中添加1.5g氢氧化钙固体，充分搅拌后，加入灭菌胆汁等体积的纯水进行稀释，最后采用400目滤网将其中的沉淀物过滤出来，过滤出的沉淀物放入至真空干燥箱中，0.085Mpa干燥24h，得到胆红素钙盐沉淀；
[0014]S6、制备可聚沉胆汁胶体：将干燥沉淀物与胆红素、胆酸、去氧胆酸、硫酸锌、硫酸镁和偏重亚硫酸钠混合均匀后，每1000ml过滤后的灭菌胆汁中添加700～2000g的混合物，搅拌混合得到浑浊的胆汁胶体；
[0015]S7、凝结核准备：将直径3mm的牛黄颗粒插入直径0.05mm的针状银质电极，并将牛黄颗粒浸泡至5％的稀盐酸中2～3min；
[0016]S8、牛黄电结石：将插有牛黄颗粒的针状银质电极接入负极，另一针状银质电极接入正极，将正负极同时插入至待凝结的胆汁胶体中，并控制牛黄颗粒缓慢转动，牛黄颗粒快速凝结，3min左右停止增大，将其取出并浸入至5％稀盐酸中2～3min，重复上述步骤直至牛黄颗粒不再变大，牛黄微粒分层吸附于牛黄凝结核心之上，形成层纹结构；
[0017]正负极之间的距离为5～7cm，并且插有牛黄颗粒的负极针状银质电极以2cm为半径进行圆周运动，旋转的角速度为1.5～2πrad/s，连接高压电泳仪电源，调节正负极通电电压为750～1300V，电流为25～30mA，并且正负极的通电电压和电流随着正负极之间距离的增加而增大；
[0018]S9、后处理：将培育后的牛黄颗粒取下后置于
‑
5℃冷冻保存5h，再放入真空干燥箱中，0.085Mpa干燥24h。
[0019]具体的，S6中的干燥沉淀物与其他物料的使用质量份数为：
[0020][0021]与现有技术相比本专利技术的有益效果为：
[0022]本专利技术将大肠杆菌优先培养于新型液体培养基中，相比于现有的胆汁培养，可以
加快繁殖速度，使大肠杆菌产生的胞内酶β
‑
葡萄糖醛酸苷酶随着分裂繁殖而大量的释放到培养基中，从而无需超声破破碎菌体，可以得到更高的反应速度的反应效率，将发酵时间由2～3天减少至7～8h，并且产率相同；
[0023]并且本专利技术中未添加肠球菌、变形杆菌等，减少α毒素、θ毒素等的产生，本专利技术将大肠杆菌(ATCC25922)作为发酵菌种，避免产生毒素的潜在风险；
[0024]本专利技术通过电结石技术产生的洛伦兹力代替传统的偏轴旋转机械运动，使用3mm左右的牛黄颗粒作为凝结核，使牛黄小颗粒更容易附着，使用电泳的原理，通过异性电荷的吸引，配合盐酸中带正电的氢离子，使牛黄小颗粒更高效的分层吸附，实现体外培育牛黄更快的凝结速度和更高的产率，电结石时间耗时短，消耗能量低，将原有的依靠机械偏轴旋转的方法将凝结时间从5～12h缩短至30min；
[0025]本专利技术改进为通过改变胶体内局部电荷分布，使胶粒自然凝结，不添加螯合物，更加逼近天然牛黄的形成过程和组成成分，避免螯合物对药效产生的影响和未知安全隐患；
[0026]且产出体外培育牛黄经液相色谱仪多批次化验测试，各种药物活性成分含量不低于现有培育方法体外培育的牛黄和天然牛黄，满足药用需求，胆酸、结合胆红素、游离胆红本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种新型体外培育牛黄电结石方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、胆汁处理：将新鲜牛胆汁过滤去除残留的肝胆组织，并将过滤后的胆汁水浴加热至96～98℃，保持10min，然后降温至36～38℃备用；S2、菌种繁殖：将大肠杆菌甘油菌种接种于扩增繁殖液体培养基中，并在36～38℃下恒温培养6～7h，得到发酵菌液；S3、酶促反应：每1000ml处理后的胆汁中加入50ml发酵菌液，混合均匀后，在36～38℃下水浴加热恒温震荡1～2h，进行酶促反应；S4、灭菌处理：将经过酶促反应后的胆汁加热至96～98℃，维持30min，完成高温灭菌，并使残留的酶失活，得到灭菌胆汁；S5、过滤沉淀：每1000ml灭菌胆汁中添加1.5g氢氧化钙固体，充分搅拌后，加入灭菌胆汁等体积的纯水进行稀释，最后将其中的沉淀物过滤出来；S6、制备可聚沉胆汁胶体：将干燥沉淀物与胆红素、胆酸、去氧胆酸、硫酸锌、硫酸镁和偏重亚硫酸钠混合均匀后，每1000ml过滤后的灭菌胆汁中添加700～2000g的混合物，搅拌混合得到浑浊的胆汁胶体；S7、凝结核准备：将直径3mm的牛黄颗粒插入直径0.05mm的针状银质电极，并将牛黄颗粒浸泡至5％的稀盐酸中；S8、牛黄电结石：将插有牛黄颗粒的针状银质电极接入负极，另一针状银质电极接入正极，将正负极同时插入至待凝结的胆汁胶体中，并控制牛黄颗粒缓慢转动，直至牛黄颗粒停止变大，将其取出并浸入至5％稀盐酸中，重复上述步骤直至牛黄颗粒不再变大；S9、后处理：将培育后...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖德煊，王彦博，
申请(专利权)人：肖德煊，
类型：发明
国别省市：