一种检测大肠菌群的方法技术

本发明专利技术属于大肠菌群的检测领域，具体公开了一种检测大肠菌群的方法，方法中的检测溶液体系包含以下质量的组分：磷酸盐缓冲液、酵母浸粉、5

【技术实现步骤摘要】
一种检测大肠菌群的方法


[0001]本专利技术属于大肠菌群的检测领域，尤其涉及食品中(水、果汁和牛奶等) 大肠菌群的检测领域。

技术介绍

[0002]大肠菌群归类在不同的属中，其主要是根据细菌发酵乳糖的能力。然而，大肠菌群通常被描述为革兰氏阴性、杆状肠杆菌科，可发酵乳糖产生酸和气体。大肠菌群主要存在于人畜的粪便，可作为粪便污染指标来评价食品的卫生状况，以推断食品中肠道致病菌污染的可能性。大肠菌群一般认为是无害的，但是一些典型的大肠菌菌株如大肠杆菌O157:H7、肺炎克雷伯氏菌和弗氏柠檬酸杆菌对人类具有致病性。公共卫生场所的传染病传播风险引起了人们的广泛关注，其中包含了大肠菌群以及大肠菌群与其它细菌病毒交叉感染的风险。因此，检测大肠菌群对于食品卫生安全以及公共卫生安全的重要性不言而喻。
[0003]MPN法(最可能数法)和平板计数法被认为是“金标准”，因为它通过在标准条件下培养得到结果。然而，它不可避免地需要专业技术人员使用微生物细胞培养的特定设施，需经过数天的富集、涂板、分离和鉴定过程，且对存活但不可培养(VBNC)的细菌、细胞束手无策。
[0004]拥有编码β
‑
半乳糖苷酶的LacZ基因是大肠菌群最突出的特征。当前，大肠菌群的检测主要通过对其LacZ基因的AacZ序列或者其基因产物β
‑
半乳糖苷酶的检测。例如，有利用qPCR方法测定大肠菌群的Lac基因，不需要富集步骤, 灵敏度可达112CFU/mL；也有利用对其基因产物β
‑
半乳糖苷酶进行电化学方法检测，6
‑
氯
‑3‑
吲哚基
‑
β
‑
D
‑
吡喃半乳糖苷(6
‑
CIGP)作为β
‑
半乳糖苷酶反应底物，3h内可以达到1.6log10 CFU/mL至6.6log10 CFU/mL的检测限度。也有利用大肠菌群的产气特征进行检测，但在肠杆菌科中，代谢乳糖产生气体这一生化反应依赖于甲酸水解酶且容易被抑制。因此，通过产气检测大肠菌群缺乏意义。其他方法，比如试剂盒法，膜过滤法，免疫学方法，物理化学方法(电阻抗法) 以及ATP生物发光方法等。然而，这些方法都需要精密的仪器以及复杂的操作步骤和数据处理方法，须具备专业知识人员实施。因此现场检测实用性不高，难以在实际检测中快速广泛应用。
[0005]比色技术由于其易于操作，不需要多而精密的仪器和专业的知识而受到越来越多的关注。已经报道了一些用于大肠菌群相关检测的酶促测定比色方法。例如，携带LacZ操纵子的T7噬菌体被用于感染大肠杆菌，利用LacZ编码的β
‑
半乳糖苷酶的过度表达来催化比色反应。取决于大肠杆菌葡萄糖氧化酶介导的比色方法也被报道。虽然这些酶促方法操作简单，但利用噬菌体等特异性的生物识别方法通常难以应用于具有广谱性的大肠菌群检测当中。这种检测体系中通过添加酶参与比色反应，会受到各类因素干扰，比如pH、温度以及其余化合物的干扰。这使得该类检测方法，存在着较大的不稳定性，且检测限高，无法较精确测量低浓度的菌落。此外，由于食品基质的成分复杂，在食品基质中检测细菌数量，难以达到理想效果，所以此类报道中很多没有涉及食品样品中菌落的检测分析，在多场景检测应用上存在较大的限制。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种检测大肠菌群的方法。本专利技术所述方法应用了一种异丙基
‑
β
‑
D
‑
硫代半乳糖苷(IPTG)、酵母浸粉(YET)和溴
‑4‑
氯
‑3‑
吲哚
‑
β
‑
D
‑ꢀ
吡喃半乳糖苷(X
‑
Gal)混合检测体系(IPTG
‑
YET
‑
X
‑
Gal)。该检测体系首先诱导大肠菌群乳糖操纵子Lac基因的表达，使β
‑
半乳糖苷酶表达并参与代谢，使 X
‑
Gal生成蓝色化合物，通过测量吸光度(OD
655
)并结合本方法的标准曲线，计算出待测样品中的大肠菌群数量。本专利技术所述方法，使用的试剂、仪器少，操作简便；检测体系受外部环境的影响小，稳定性好，可适应各种检测环境；在现场环境下即可加样操作，无需特定的实验室条件。该方法对食品中大肠菌群的检测有着广泛的应用前景。
[0007]本专利技术目的通过以下技术方案实现：
[0008]一种检测大肠菌群的方法，检测溶液体系中包括以下组分：检测溶液体系包括以下组分：磷酸盐缓冲液、0.01～0.5g/L酵母浸粉、0.01～2g/L 5
‑
溴
‑4‑
氯
‑3‑ꢀ
吲哚
‑
β
‑
D
‑
吡喃半乳糖苷及0.024～2.4g/L异丙基
‑
β
‑
D
‑
硫代半乳糖苷。
[0009]优选地，所述的酵母浸粉的浓度为0.05～0.2g/L；所述的5
‑
溴
‑4‑
氯
‑3‑
吲哚
‑ꢀ
β
‑
D
‑
吡喃半乳糖苷的浓度为0.1～0.3g/L；所述的异丙基
‑
β
‑
D
‑
硫代半乳糖苷的浓度为0.024～0.36g/L。
[0010]一种检测大肠菌群的方法，包括以下步骤：
[0011](1)将异丙基
‑
β
‑
D
‑
硫代半乳糖苷、5
‑
溴
‑4‑
氯
‑3‑
吲哚
‑
β
‑
D
‑
吡喃半乳糖苷、酵母浸粉及磷酸盐缓冲液混合均匀，配制得到检测溶液体系；
[0012](2)将待测样品和步骤(1)中检测溶液体系混匀，恒温培养1
‑
12h，测量 655nm处的吸光度；
[0013](3)根据测得的吸光度结合标准曲线，得出样品中大肠菌群数目。
[0014]优选地，所述的恒温为37℃，培养4
‑
9h。
[0015]优选地，所述YET浓度为0.1g/L。
[0016]优选地，所述为X
‑
Gal浓度0.2g/L。
[0017]优选地，所述IPTG浓度为0.024g/L。
[0018]优选地，所述培养温度为37℃，培养时间为9h。
[0019]检测溶液体系的检测范围为103～107CFU/mL。
[0020]所述的标准曲线的绘制包括如下步骤：
[0021](1)将异丙基
‑
β
‑
D
‑
硫代半乳糖苷、5
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测大肠菌群的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)将异丙基
‑
β
‑
D
‑
硫代半乳糖苷、5
‑
溴
‑4‑
氯
‑3‑
吲哚
‑
β
‑
D
‑
吡喃半乳糖苷、酵母浸粉及磷酸盐缓冲液混合均匀，配制得到检测溶液体系；其中，酵母浸粉、5
‑
溴
‑4‑
氯
‑3‑
吲哚
‑
β
‑
D
‑
吡喃半乳糖苷、异丙基
‑
β
‑
D
‑
硫代半乳糖苷的浓度分别为0.01～0.5g/L、0.01～2g/L、0.024～2.4g/L；(2)将待测样品和步骤(1)中检测溶液体系混匀，恒温培养1
‑
12h，测量655nm处的吸光度；(3)根据测得的吸光度结合标准曲线，得出样品中大肠菌群数目。2.根据权利要求1所述一种检测大肠菌群的方法，其特征在于：所述的酵母浸粉的浓度为0.05～0.2g/L；所述的5
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溴
‑4‑
氯
‑3‑
吲哚
‑
β
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D
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吡喃半乳糖苷的浓度为0.1～0.3g/L；所述的异丙基
‑
β
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D
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硫代半乳糖苷的浓度为0.024～0.36g/L。3.根据权利要求1或2所述一种检测大肠菌群的方法，其特征在于：所述的标准曲线的绘制包括如下步骤：(1)将异丙基<...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖性龙，刘西敏，王璐莹，李晓凤，余以刚，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：