结合HER2的多价双特异性抗体、其制备方法和用途技术

本发明专利技术涉及抗体领域，构建了一种可以同时结合HER2的胞外区结构域Ⅱ和Ⅳ的多价双特异性抗体，应用于制备治疗癌症和炎性疾病、自体免疫性疾病和其它病症的药物，具有良好的临床应用前景。应用前景。

【技术实现步骤摘要】
结合HER2的多价双特异性抗体、其制备方法和用途


[0001]本专利技术属于抗体领域，涉及一种结合HER2的多价双特异性抗体、其制备方法和用途。

技术介绍

[0002]HER受体(human epidermal growth factor receptor)家族由4个结构相近的受体酪氨酸激酶蛋白成员组成，分别称ErbB-1(EGFR或Her-1)、ErbB-2(Her-2)、ErbB-3(Her-3)、ErbB-4(Her-4)，是具有配体依赖性的跨膜糖蛋白家族，均属于I型酪氨酸激酶受体基因家族(Receptor tyrosine kinase，RTKs)。除造血干细胞外，存在于大多数细胞中，在多种肿瘤中都有过表达，如结直肠癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌和非小细胞肺癌等。其蛋白质结构可以分为3个区域，即胞外区、跨膜区和胞内区。胞外区含有4个结构域：结构域Ⅰ和Ⅲ为配体结合结构域；结构域Ⅱ和Ⅳ同源性较高，为二聚化结合区。胞内区又可分为酪氨酸激酶结构域和C端结构域两部分，前者有腺苷三磷酸(ATP)结合位点，ATP结合后可将磷酸基团转移；后者有多个酪氨酸残基，可被磷酸化并直接参与细胞内信号转导。
[0003]HER受体间可发生同源二聚化(两种相同的受体间)或异源二聚化(两种不同的受体间)，二聚化是HER家族发挥其功能及信号转导活性的基本条件。受体二聚化后，诱导胞内高度保守的酪氨酸激酶区发生交叉磷酸化，进而招募并激活下游蛋白，调节MAPK通路或激活PI3K/AKT通路，引起信号级联反应，调节细胞的生长及分裂，并参与肿瘤细胞的增殖、浸润及血管生成等。
[0004]尽管HER家族的4个成员具有相同的结构区域，但各成员的功能活性并不相同。HER2胞外区结构为天然的开放构象，此构象使HER2无需配体激活即可与其他受体发生二聚化。HER2是一种有效的乳腺癌治疗靶点，约四分之一的乳腺癌患者中过表达。HER2的过表达或突变导致它组成性活化，驱动多种癌症的形成，像乳腺癌，口腔癌，胰腺癌和肺癌。
[0005]曲妥珠单抗(Trastuzumab)是一种重组人源化IgG1/Kappa单克隆抗体，以高亲和力选择性结合HER2的胞外区结构域Ⅳ，阻止HER2同二聚化，抑制过表达HER2的人肿瘤细胞的增殖，具有抗体依赖的细胞毒性效应(ADCC)。Trastuzumab在1998年被批准用于治疗HER2过表达性转移性乳腺癌的患者。2006年美国FDA批准用于治疗进行过手术的早期乳腺癌女性。尽管Trastuzumab让HER2阳性乳腺癌的治疗取得了极大的进步,但受“Trastuzumab+化疗”辅助治疗(术后给药，杀灭残留癌细胞)的患者仍有1/3会最终复发。
[0006]帕妥珠单抗(通用名Pertuzumab)是一种重组人源化单克隆抗体，其能够阻止HER2受体与细胞表面上的其它HER受体(HER1，HER3和HER4)异二聚化，由此抑制与肿瘤生长和进展有关的下游信号传导。Pertuzumab结合HER2胞外区结构域II的β-发夹和周围区域(与Trastuzumab不同的表位)。β-发夹对于与其它HER受体形成二聚体是至关重要的。通过结合这一表位，Pertuzumab能够抑制HER2异二聚体形成和后续PI3K/AKT促有丝分裂途径信号传导级联激活。在2012年美国FDA批准Pertuzumab用于治疗晚期或晚期阶段(转移性)HER2阳性乳腺癌患者。在2013年9月30日，Pertuzumab凭借病理学的应答率数据被FDA加速批准，与
determining region，CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为框架区(frame region，FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等，NIH Publ.No.91-3242，卷I，647-669页(1991))。本专利技术四价、三价双特异性抗体的VHa优选自Pertuzumab重链可变区或有突变的Pertuzumab重链可变区、VHb优选自Trastuzumab重链可变区，二价双特异性抗体的VHa优选自Trastuzumab重链可变区、VHb优选自Pertuzumab重链可变区或有突变的Pertuzumab重链可变区。
[0018]本专利技术中，术语“特异性结合”和“结合”是指两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。通常，抗体以小于大约10-7
M，例如小于大约10-8
M、10-9
M、10-10
M、10-11
M或更小的平衡解离常数(KD)结合该抗原。本专利技术中，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。例如，使用表面等离子体共振术(Surface Plasmon Resonance，缩写SPR)在BIACORE仪中测定抗体与抗原的结合亲和力或使用ELISA测定抗体与抗原结合的相对亲和力。
[0019]本专利技术中，术语“价”是指抗体分子中存在指定数量的抗原结合位点。本专利技术中，抗原结合位点包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。
[0020]本专利技术中，术语“共同轻链”是指包含相同的轻链可变区和轻链恒定区的轻链，其能够与结合第一抗原的第一抗体的重链配对，形成特异性结合第一抗原的结合位点，也能够与结合第二抗原的第二抗体的重链配对，形成特异性结合第二抗原的结合位点。进一步的，共同轻链的轻链可变区与第一抗体的重链可变区形成第一抗原结合位点，共同轻链的轻链可变区与第二抗体的重链可变区形成第二抗原结合位点。
[0021]本专利技术中，术语“肽接头”是指具有氨基酸序列的肽。本专利技术的肽接头是天然连接子或人工连接子。优选的，本专利技术的肽接头是人工连接子。本专利技术的多肽接头可以选自G、GS、SG、GGS、GSG、SGG、GGG、GGGS、SGGG、GGGGS、GGGGSGS、GGGGSGGS、GGGGSGGGGS、GGGGSGGGGSGGGGS、AKTTPKLEEGEFSEAR、AKTTPKLEEGEFSEARV、AKTTPKLGG、SAKTTPKLGG、SAKTTP、RADAAP、RADAAPTVS、RADAAAAGGPGS、SAKTTPKLEEGEFSEARV、ADAAP、ADAAPTVSIFPP、TVAAP、TVAAPSVFIFPP、QPKAAP、QPKAAPSVTLFPP、AKTTPP、AKTTPPSVTPLAP、AKTTAPSVYPLAP、ASTKGP、ASTKGPSVFPLAP、GENKVEYAPALMALS、GPAKELTPLKEAKVS和GHEAAAVMQVQYPAS等。接头还可以是在体内可断裂的肽接头、蛋白酶(如MMP)敏感性接头、可以通过还原而断裂的基于二硫键的接头等，参见先前所描述的(Fus本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
CH2-CH3来自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的重链恒定区，优选自IgG1或IgG4的重链恒定区。8.如权利要求2所述的双特异性抗体，其特征在于，所述VHa的氨基酸序列选自SEQ ID NO：3或40；VHb的氨基酸序列选自SEQ ID NO：1；VL的氨基酸序列选自SEQ ID NO：2或41。9.如权利要求2所述的双特异性抗体，其特征在于，所述多肽链和所述共同轻链的氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO：19、10；SEQ ID NO：19、16；SEQ ID NO：23、16。10.如权利要求3所述的双特异性抗体，其特征在于，所述多肽链中CH1a结构域和CH1b-CH2-CH3a、CH1b-CH2-CH3b来自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的重链恒定区，优选自IgG1的重链恒定区。11.如权利要求10所述的双特异性抗体，其特征在于，所述IgG1包含H435R、Y436F突变。12.如权利要求3所述的双特异性抗体，其特征在于，所述VHa的氨基酸序列选自SEQ ID NO：3或40；VHb的氨基酸序列选自SEQ ID NO：1；VL的氨基酸序列选自SEQ ID NO：2或41。13.如权利要求3所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一条多肽链、第二条多肽链和共同轻链的氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO：27、45、10；SEQ ID NO：27、45、16；SEQ ID NO：31、45、16。14.如权利要求4所述的双特异性抗体，其特征在于，所述多肽链中-CH1-CH2-CH3a、-CH1-CH2-CH3b来自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的重链恒定区，优选自IgG1的重链恒定区。15.如权利要求14所述的双特异性抗体，其特征在于，所述IgG1包含H435R、Y436F突变。16.如权利要求4所述的双特异性抗体，其特征在于，所述VHa和VHb的氨基酸序列各自独立的选自SEQ ID NO：1、3或40，并且VHa与VHb的氨基酸序列不相同；VL的氨基酸序列选自SEQ ID NO：2或41。17.如权利要求4所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一条多肽链、第二条多肽链和共同轻链的氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO：35、37、10；SEQ ID NO：35、37、16；SEQ ID NO：35、39、10；SEQ ID NO：35、39、16。18.一种分离的核苷酸，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵杰，黄浩旻，朱祯平，
申请(专利权)人：三生国健药业上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：