一种手性氨基酸的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种手性氨基酸的检测方法，包括以下的步骤：（1）衍生：将标准的氨基酸样品与待测的氨基酸样品分别进行衍生，衍生的条件如下：在

【技术实现步骤摘要】
一种手性氨基酸的检测方法


[0001]本专利技术涉及氨基酸的检测
，尤其是一种手性氨基酸的检测方法。

技术介绍

[0002]氨基酸是构成蛋白质的基本组成单位，同时也直接参与许多生命活动。在构成人体蛋白质的20种基本氨基酸中，除了甘氨酸外都具有手性，因此这些氨基酸都存在着L型和D型两种手性同分异构体。生命体中D型氨基酸的含量水平和各种生命现象息息相关，可以反映诸如疾病的发生和进程、细菌的感染和繁殖等等。例如，血液中D
‑
丝氨酸，D
‑
脯氨酸和D
‑
天冬酰胺的水平与肾功能密切相关，而D
‑
天冬氨酸和D
‑
脯氨酸的水平与糖尿病密切相关（Scientific Reports, 2016：26137）。现代食品以及营养学上对于氨基酸手性异构体的分析也具有很大的意义。例如，牛奶中D
‑
丙氨酸（D
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Ala）的浓度升高可以揭示微生物对牛奶的污染（Acta Universitatis Cibiniensis Series E Food Technology, 2008,12:3
‑
18），葡萄酒和醋中的D
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脯氨酸含量，则可被用于鉴定产品的发酵年份（Methods Enzymol，1984，106:98
‑
115）。
[0003]现有成熟的氨基酸检测方法，包括茚三酮染色以及氨基酸分析仪等，都不涉及氨基酸手性异构体的测定（GB/T5009.124
‑
2003，GB/T18246
‑
2000）。氨基酸手性异构体的分离检测常用的方法有化学拆分法和物理拆分法。化学拆分法工艺较为常熟，多用于工业生产，但是产品的拆分率、产物光学纯度都不高，污染和能耗也较大，不适用于样品的精确检测分析。物理拆分法包括膜拆分、毛细管电泳拆分、色谱拆分等。其中膜拆分受制于膜的稳定性和使用寿命，不适用于高通量快速检测分析；毛细管电泳拆分尽管分辨率高，但是一次只能拆分一种或少数几种氨基酸的手性异构体，不适用于复杂实际样品的分析检测；色谱拆分法适用范围较广、灵敏度较高，能实现复杂样品中的氨基酸手性异构体检测分析。但是色谱拆分氨基酸手性异构体需要采用昂贵的手性色谱柱。并且由于大部分氨基酸在紫外光区没有吸收和特征荧光，因此在常用的色谱紫外检测器中的效果并不好。
[0004]为了解决以上问题，通常对待检测的含手性氨基酸样品进行（色谱）柱前衍生，以提高对手性氨基酸的检测灵敏度和色谱分离度。已报道的氨基酸手性衍生试剂可以分为羧基衍生试剂和胺基衍生试剂，这些衍生化试剂自身具有手性，在与待测的氨基酸样品通过化学反应结合后，使待测的氨基酸对映异构体引入额外的手性中心，成为非对映异构体，从而可以在非手性色谱柱中实现分离。
[0005]然而现有技术的衍生化方法需对衍生化后的样品进行萃取分离，衍生化过程繁琐，检测方法灵敏度不高且需要特定的检测器进行测试，对复杂体系中低水平含量的手性氨基酸难以进行检测，同时目前大部分衍生化标记试剂需要使用氨基酸的氨基发生醛胺缩合反应来结合标记基团，因此对酸性氨基酸（如天冬氨酸、谷氨酸）或者氨基为二级胺的氨基酸（如脯氨酸）不适用。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种手性氨基酸的检测方法，操作简便，无需对衍生化后的样品进行萃取分离，可利用多种检测器进行检测氨基酸手性异构体的含量，灵敏度高，同时对复杂体系中低水平含量的手性氨基酸能够进行检测，也可以对酸性氨基酸以及对含二级胺的脯氨酸的氨基酸手性异构体进行检测。
[0007]为了解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：一种手性氨基酸的检测方法，包括以下的步骤：（1）衍生：将标准的氨基酸样品与待测的氨基酸样品分别进行衍生化，分别得到所述的衍生化的标准的氨基酸样品与所述的衍生化的待测的氨基酸样品；所述的衍生化的条件如下：在
‑
20℃~40℃条件下，将亚膦酸酯衍生化试剂、卤代试剂、碱、有机溶剂、水和氨基酸混合反应，反应时间为0.1~100小时，得到衍生化的氨基酸；其中，所述的亚膦酸酯衍生化试剂的化合物结构如下所示：其中，R1为芳基基团；R2为含有手性的烷氧取代基。
[0008]（2）检测：将所述的步骤（1）的所述的衍生化的标准的氨基酸样品与所述的衍生化的待测的氨基酸样品通过同一光学检测器并在同等参数条件下检测，得到的谱图进行比对和定性定量分析。
[0009]所述的芳基基团选自苯基、苯氧基、噻吩基或呋喃基中的一种。
[0010]所述的含有手性的烷氧取代基选自L
‑
薄荷醇基、D
‑
薄荷醇基、(R)
‑
(+)
‑1‑
苯基
‑1‑
丙醇基或(S)
‑
(
‑
)
‑1‑
苯基
‑1‑
丙醇基中的一种。
[0011]所述的亚膦酸酯衍生化试剂:所述的卤代试剂:所述的碱:所述的氨基酸的摩尔质量比为（10
‑
50）：（100
‑
300）：（10
‑
200）：1；所述的有机溶剂的体积、所述的水的体积与所述的氨基酸的摩尔质量比为（100
‑
400）mL：（50
‑
200）mL：1 mmol。
[0012]所述的碱与所述的氨基酸的摩尔质量比为（10
‑
20）：1。
[0013]所述的卤代试剂为四氯化碳、四溴化碳、六氯乙烷、次氯酸钠、次氯酸或次溴酸钠。
[0014]所述的碱为三乙胺、三异丙胺、苯胺、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠或碳酸铯。
[0015]所述的有机溶剂选自乙醇、乙腈、四氢呋喃、二甲亚砜、N,N
‑
二甲基甲酰胺或乙酸乙酯中的一种或多种。
[0016]所述的光学检测器为高效液相色谱
‑
质谱联用仪或核磁共振波谱仪。
[0017]本专利技术的优点在于：1.本专利技术的亚膦酸酯衍生化试剂中含有芳基基团和手性中心，对氨基酸进行衍生化反应，衍生化后的氨基酸分子可在紫外检测器中出现信号；同时亚膦酸酯衍生化试剂中还含有手性中心，为氨基酸手性异构体分子引入第二个手性中心，使一对对映异构体变为非对映异构体，从而在不需要特殊手性色谱柱的情况下，使用廉价、常用的非手性色谱柱即可进行分离分析，大大拓宽了检测方法中所采用的检测器的选择范围，且亚膦酸酯衍生化试剂的所需合成原料都为市场价格低廉的药品，合成步骤简单。
[0018]2.本专利技术公开的一种手性氨基酸的检测方法操作简便，无需对衍生化后的样品进
行萃取分离，尤其适用于对含有氨基的手性代谢产物如氨基酸、小肽或多肽等样品进行衍生化标记，并采用液相色谱
‑
质谱联用或核磁共振
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磷谱技术进行定性定量分析。
[0019]3.本专利技术利用亚膦酸酯衍本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种手性氨基酸的检测方法，其特征在于包括以下的步骤：（1）衍生：将标准的氨基酸样品与待测的氨基酸样品分别进行衍生化，分别得到所述的衍生化的标准的氨基酸样品与所述的衍生化的待测的氨基酸样品；所述的衍生化的条件如下：在
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20℃~40℃条件下，将亚膦酸酯衍生化试剂、卤代试剂、碱、有机溶剂、水和氨基酸混合反应，反应时间为0.1~100小时，得到衍生化的氨基酸；其中，所述的亚膦酸酯衍生化试剂的化合物结构如下所示：其中，R1为芳基基团；R2为含有手性的烷氧取代基；（2）检测：将所述的步骤（1）的所述的衍生化的标准的氨基酸样品与所述的衍生化的待测的氨基酸样品通过同一光学检测器并在同等参数条件下检测，得到的谱图进行比对和定性定量分析。2.根据权利要求1所述的一种手性氨基酸的检测方法，其特征在于所述的芳基基团选自苯基、苯氧基、噻吩基或呋喃基中的一种。3.根据权利要求1所述的一种手性氨基酸的检测方法，其特征在于所述的含有手性的烷氧取代基选自L
‑
薄荷醇基、D
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薄荷醇基、(R)
‑
(+)
‑1‑
苯基
‑1‑
丙醇基或(S)
‑
(
‑
)
‑1‑
苯基
‑1‑
丙醇基中...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴翊乐，史雅平，张振宾，应见喜，赵玉芬，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：