一种制备高聚合度壳寡糖的方法技术

本发明专利技术公开了一种制备高聚合度壳寡糖的方法：向含有Mn

【技术实现步骤摘要】
一种制备高聚合度壳寡糖的方法


[0001]本专利技术涉及一种制备高聚合度壳寡糖的方法，属于发酵工程、生化工程领域。

技术介绍

[0002]壳聚糖具有许多重要的生物活性，但壳聚糖溶解度低，不溶于水、碱性溶液及有机溶剂，仅溶于稀酸，当溶液中的壳聚糖浓度达到5％以上时基本失去流动性，这些性质限制了壳聚糖在食品、药品和纺织等相关行业的应用。而壳聚糖的水解产物壳寡糖由于分子链较短具有良好的水溶性，与大分子壳聚糖相比具有更高的生物活性。壳寡糖可抗肿瘤、降血糖、促进有益菌群增生，作为化妆品保湿剂、植物生长调节剂等等，在生产生活上具有广阔的应用前景。
[0003]目前制备壳寡糖的方法主要有物理法、化学法和酶解法等，目前工业化生产壳寡糖主要方法是化学降解法，但该方法产物不均一、分离困难且污染严重，得到的产物均一度很低基本为单糖。而酶解法反应条件温和易控制、产率高、基本无污染，是一种生产壳寡糖较为优良的方法。专一性酶解法即利用壳聚糖酶降解壳聚糖获得壳寡糖，因此利用壳聚糖酶降解壳聚糖从而产生壳寡糖是一种较为可行的方法。而目前高产酶菌株大多数为胞内酶，发酵周期长，高浓度底物酶解效率低，产物聚合度集中在1～3，高聚合度壳寡糖含量不高，难以满足工业化制备壳寡糖的需要。

技术实现思路

[0004]针对上述现有技术，本专利技术提供了一种制备高聚合度壳寡糖的方法。
[0005]本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0006]一种制备高聚合度壳寡糖的方法：向含有Mn
2+
的壳聚糖溶液中加入壳聚糖酶或含有壳聚糖酶的溶液，进行酶解，即得聚合度为3～6的壳寡糖；所述壳聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0007]壳聚糖酶的氨基酸序列如下所示(如SEQ ID NO.1所示)：
[0008]MNGKRNIFTCISIVGIGLASFSNSSFAASVTDNSIQNSIPVVNQQVTAAKEMKPFPQQVNYAGVIKPNHVTQESLNASVRSYYDNWKKKYLKNDLSSLPGGYYVKGEITGDADGFKPLGTSEGQGYGMIITVLMAGYDSNAQKIYDGLFKTARTFKSSQNPNLMGWVVADSKKAQGHFDSATDGDLDIAYSLLLAHKQWGSNGAVNYLKEAQDMITKGIKASNVTNNSRLNLGDWDSKSSLDTRPSDWMMSHLRAFYEFTGDKTWLTVINNLYDVYTQFSNKYSPNTGLISDFVVKNPPQPAPKDFLNESEYTNAYYYNASRVPLRIVMDYAMYGEKRSKVISDKVSSWIQNKTNGNPSKIVDGYQLNGSNIGSYPTGVFVSPFIAASITNSNNQKWVNSGWDWMKNKREGYFSDSYNLLTMLFITGNWWKPIPDNKKTQNQINDAIYEGYDN。
[0009]进一步地，所述壳聚糖溶液的浓度为6％～10％(质量体积比，单位mg/ml)，溶质为2％～3％(质量百分数)的醋酸溶液。
[0010]进一步地，所述壳聚糖溶液中Mn
2+
的浓度为1～20mmol/L，优选2～10mmol/L，更优选2mmol/L、5mmol/L。
[0011]进一步地，所述Mn
2+
是以可溶性锰盐的方式加入到壳聚糖溶液中的，比如氯化锰、硫酸锰。
[0012]进一步地，所述壳聚糖酶的加酶量2.0～3.0U/g壳聚糖，优选2.5U/g。
[0013]进一步地，所述酶解的温度为52～58℃，优选55℃，酶解时间为4～7h，优选6h、7h。
[0014]进一步地，所述含有壳聚糖酶的溶液，可通过以下方法制备得到：向发酵培养基中接种能表达SEQ ID NO.1所示的壳聚糖酶的枯草芽孢杆菌或其种子液，进行发酵；发酵结束后，发酵液离心，得上清液，即为含有壳聚糖酶的溶液。
[0015]所述枯草芽孢杆菌，为已经公开的菌株(可自菌种保藏人或菌种保藏机构购买得到)，来自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为Bacillus subtilis，保藏编号为CGMCC No.1.14985，保藏日期为2014年12月10日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏人为本专利技术的第一专利技术人；该枯草芽孢杆菌的生物学特性为：显微镜镜检菌株形态为杆状，属于革兰氏阳性菌，平板划线培养的形态为不透明、边缘不整齐的乳白色圆形菌落；该枯草芽孢杆菌能表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的壳聚糖酶。虽然该枯草芽孢杆菌是现有技术中已经公开的菌株，本领域技术人员知晓其基因组中含有能表达壳聚糖酶的基因，但这仅是从基因序列的同源性上得出的结论，现有技术中并未对其所能表达的壳聚糖酶进行具体的表达和研究，不知晓该壳聚糖酶具有何种性质；本专利技术首次对该枯草芽孢杆菌所能表达的壳聚糖酶进行了实际的制备和研究，并发现了其特性。另外，也可将编码SEQ ID NO.1所示的壳聚糖酶的基因片段(可从保藏编号为CGMCC No.1.14985的菌株中扩增得到，也可人工合成，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，可进一步依据密码子偏好等进行优化)通过基因重组的方式导入常规的枯草芽孢杆菌中。
[0016]该基因的核苷酸序列如下所示(如SEQ ID NO.2所示)：
[0017]5’‑
[0018]ATGAATGGAAAAAGAAATATTTTCACATGTATTTCTATTGTAGGAATCGGACTAGCTAGTTTTTCTAATTCTAGTTTCGCTGCAAGTGTAACGGACAATTCAATACAAAATTCTATTCCTGTAGTTAATCAACAAGTAACTGCTGCAAAGGAAATGAAACCATTTCCCCAGCAAGTTAATTATGCAGGTGTTATAAAACCGAATCATGTTACACAAGAAAGTTTAAATGCTTCTGTAAGAAGTTACTACGATAATTGGAAAAAGAAATATTTGAAAAATGATTTATCTTCTTTACCTGGTGGTTATTACGTAAAAGGAGAGATTACAGGTGATGCGGATGGGTTTAAGCCACTTGGAACTTCAGAAGGTCAAGGGTATGGGATGATAATTACAGTATTAATGGCCGGTTATGATTCGAATGCTCAAAAAATCTATGACGGTTTATTTAAAACAGCAAGAACTTTTAAAAGCTCTCAAAATCCTAATTTAATGGGATGGGTTGTCGCAGATAGTAAAAAAGCACAAGGTCATTTTGATTCTGCTACTGATGGGGATTTAGATATTGCGTATTCTCTTCTTCTTGCTCACAAGCAGTGGGGATCAAATGGAGCAGTTAATTATTTAAAAGAAGCACAAGACATGATTACAAAAGGTATTAAAGCTAGTAATGTTACAAATAA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备高聚合度壳寡糖的方法，其特征在于：向含有Mn
2+
的壳聚糖溶液中加入壳聚糖酶或含有壳聚糖酶的溶液，进行酶解，即得聚合度为3～6的壳寡糖；所述壳聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的制备高聚合度壳寡糖的方法，其特征在于：所述壳聚糖溶液的浓度为6％～10％，溶质为2％～3％的醋酸溶液；所述壳聚糖溶液中Mn
2+
的浓度为1～20mmol/L；所述壳聚糖酶的加酶量2～3U/g壳聚糖；所述酶解的温度为52～58℃，酶解时间为4～7h。3.根据权利要求2所述的制备高聚合度壳寡糖的方法，其特征在于：所述壳聚糖溶液的浓度为6％、8％或10％，溶质为2％～3％的醋酸溶液；所述壳聚糖溶液中Mn
2+
的浓度为2mmol/L或5mmol/L；所述壳聚糖酶的加酶量2.5U/g壳聚糖；所述酶解的温度为55℃，酶解时间为6或7h。4.根据权利要求1所述的制备高聚合度壳寡糖的方法，其特征在于：所述含有壳聚糖酶的溶液，通过以下方法制备得到：向发酵培养基中接种能表达SEQ ID NO.1所示的壳聚糖酶的枯草...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛相朝，王永臻，苏海鹏，尹丽丽，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：