提高银杏叶中银杏萜内酯含量的微生物功能菌群及其制备和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种提高银杏叶中银杏萜内酯含量的微生物功能菌群及其制备和应用。本发明专利技术的微生物功能菌群具有多菌种、多功能和易定植的特性，能有效提高土壤有机质含量，加快物质转化，促进植物生长和物质合成，而且具有拮抗重金属离子、解钾、解磷、固氮的功能。将所述功能菌群施用于银杏苗，在九、十月份，银杏叶中银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C和白果内酯的含量增加分别在74％

【技术实现步骤摘要】
提高银杏叶中银杏萜内酯含量的微生物功能菌群及其制备和应用


[0001]本专利技术涉及到一种可显著提高银杏叶中银杏萜内酯含量的微生物功能菌群及其制备和应用方法，属于微生物提升有效药用成分


技术介绍

[0002]药用植物是中医药事业的原材料，我国拥有世界上最丰富的药用植物资源。目前，对药用植物的研究主要集中在天然有效成分的提取、药用部位及药用成分的开发、遗传多样性研究、分类学研究和连作障碍研究等。银杏也同样如此。银杏与其根际微生物之间也存在着相互作用。药用植物存活以及药用部位产量和质量会受到多种因素的影响，其中药用植物根际微生物的影响是近几年关注和研究的热点内容。然而，目前相关研究对促银杏药用成分合成的关键微生物鲜见报道。
[0003]银杏萜内酯的含量是银杏叶及其制剂质量控制的关键指标，一直是备受研究学者关注。银杏萜内酯是血小板活化因子的天然拮抗剂，也是治疗心血管疾病的首选天然药物。银杏萜内酯由倍半萜内酯(白果内酯)和二萜内酯(银杏内酯)组成，是银杏叶中一类重要的活性成分。具体来说，银杏萜内酯多达十几种，其中银杏内酯B的生物活性最强；白果内酯属倍半萜内酯，是目前从银杏叶中发现的唯一的一个倍半萜内酯化合物。但是，天然银杏萜内酯因其在银杏叶中含量很低(一般在0.25％以下)且产量有限而未得到充分的开发和应用。
[0004]目前，针对提高银杏萜类内酯的生产，已有研究方法主要包括多种物理、生物、化学的方法。除了对银杏种植条件的调整优化之外，研究者们对银杏萜内酯的化学合成也进行了研究。但因银杏萜内酯分子结构复杂，化学合成技术难度大，成本高，难以规模化生产。已有的生物学方法包括银杏组织和细胞培养、基因工程等生物技术也很难实现。近年来，学者利用从银杏的根、茎中分离得到的天然菌株曲霉属、盘长孢属、孢霉属、尖孢镰刀菌等真菌均能生产银杏内酯及其类似物。利用菌类生产银杏内酯具有产量高、成分单一等优点，应用前景较好，但目前发现的内生微生物极少达到工业化生产标准。总之，目前仍以银杏叶为底物溶剂提制法最有市场发展前景，而有效提高银杏叶中银杏萜内酯的含量就变得尤为重要。重组菌群体系用于提高植物药用有效成分仍然处于起步阶段。重组微生物体系的构建，可以避免化学合成、基因工程以及生物合成等方法带来的诸多不足，应用前景较好，能够促进微生物菌剂施用指标的完善，对银杏萜内酯生产具有重要的意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的首要目的是针对现有银杏叶中银杏萜内酯含量低、生产方法不成熟的问题，提供一种可显著提高银杏叶中银杏萜内酯含量的微生物功能菌群及其制备方法，有效促进了银杏代谢及银杏叶内银杏萜内酯的积累，大大提高了银杏萜内酯的产量。
[0006]本专利技术的目的是通过以下方式实现的。
[0007]一种提高银杏叶中银杏萜内酯含量的微生物功能菌群，所述功能菌群包括：灰绿
链霉菌(Streptomyces griseoviridis)、类芽孢杆菌(Paenibacillusprosopidis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、嗜根寡养单胞菌(Stenotrophomonas rhizophila)、苍白杆菌(Ochrobactrumpecoris)、内生固氮菌(Herbaspirillumfrisingense)以及奥氏根瘤菌(Rhizobium alamii)混合而成。
[0008]进一步地，所述功能菌群包括：灰绿链霉菌(Streptomyces griseoviridis)ATCC23920、类芽孢杆菌(Paenibacillusprosopidis)DSM 22405、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 6051、嗜根寡养单胞菌(Stenotrophomonas rhizophila)DSM 14405、苍白杆菌(Ochrobactrumpecoris)DSM 23868、内生固氮菌(Herbaspirillumfrisingense)DSM 13128以及奥氏根瘤菌(Rhizobium alamii)LMG24466混合而成。
[0009]所述的微生物功能菌群，均按照2
‑
10％的接种量接种混合培养得到功能菌群。
[0010]进一步地，所述的微生物功能菌群：先将各种微生物单独培养，当达到对数生长期时，再混合培养得到功能菌群。
[0011]更进一步地，菌株单独培养和混合菌群一起培养时的培养基均为添加0.1
‑
0.15g/L氯霉素的马铃薯葡萄糖培养基；培养条件均为：温度为25
‑
30℃，转速为150
‑
160rpm，初始pH值为6.5
‑
8.0，培养时间为2
‑
4天。
[0012]上述培养基为0.1
‑
0.15g/L氯霉素的马铃薯葡萄糖培养基(PDB)，以调控微生物的代谢和减少污染。加入氯霉素，细菌在液体中生长状态会比较好，更主要这些细菌都具有氯霉素抗性。
[0013]所述的微生物功能菌群，在单独培养菌株和培养混合菌群时，需要严格遮光。
[0014]在培养过程中，进行遮光处理，以避免光对微生物代谢产生影响。有些菌在光照24小时后发酵液会发红，形态明显改变。
[0015]本专利技术的第二个目的是提供所述的微生物功能菌群的应用方法，将所述的微生物功能菌群加入到银杏根围土壤中以提高银杏叶中银杏萜内酯含量。
[0016]进一步地，在混合菌群培养完成后，离心去掉上清液，加入PDB培养基，重悬后，再次离心，重复洗涤3
‑
6次，待洗涤完成后，收集到的菌体用PDB培养基稀释成菌悬液，并采用一次性灌根接种施用。
[0017]更进一步地，在混合菌群培养完成后，离心，去掉上清液，加入等量PDB培养基，重悬后，再次离心，重复洗涤3
‑
6次，待洗涤完成后，收集到的菌体用PDB培养基稀释成1
×
108‑1×
109CFU
·
mL
‑1菌悬液，并采用一次性灌根接种按照银杏盆栽土壤质量(kg)：功能微生物菌群菌悬液体积(L)＝20:1
‑
30:1的接种量施用。
[0018]最优选：在混合菌群培养完成后，3000
‑
5000rpm离心8
‑
10分钟，去掉上清液，加入等量PDB培养基，重悬后，再次离心，重复洗涤3
‑
6次，待洗涤完成后，收集到的菌体用PDB培养基稀释成1
×
108‑1×
109CFU
·
mL
‑1菌悬液，并采用一次性灌根接种法按照银杏盆栽土壤质量(kg)：功能微生物菌群发酵液体积(L)＝20:1
‑
30:1的接种量施用。
[0019]作为进一步的改进，自施加功能微生物菌群后，对银杏树进行定期浇水，并每隔一个月采集一次银杏叶，经105℃杀青后，55℃烘箱烘4
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高银杏叶中银杏萜内酯含量的微生物功能菌群，其特征在于，所述功能菌群包括：灰绿链霉菌(Streptomyces griseoviridis)、类芽孢杆菌(Paenibacillusprosopidis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、嗜根寡养单胞菌(Stenotrophomonas rhizophila)、苍白杆菌(Ochrobactrumpecoris)、内生固氮菌(Herbaspirillumfrisingense)以及奥氏根瘤菌(Rhizobium alamii)混合而成。2.根据权利要求1所述的微生物功能菌群，其特征在于，所述功能菌群包括：灰绿链霉菌(Streptomyces griseoviridis)ATCC 23920、类芽孢杆菌(Paenibacillusprosopidis)DSM 22405、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 6051、嗜根寡养单胞菌(Stenotrophomonas rhizophila)DSM 14405、苍白杆菌(Ochrobactrumpecoris)DSM 23868、内生固氮菌(Herbaspirillumfrisingense)DSM 13128以及奥氏根瘤菌(Rhizobium alamii)LMG 24466混合而成。3.根据权利要求1所述的微生物功能菌群，其特征在于，均按照2
‑
10％的接种量接种混合培养得到功能菌群。4.根据权利要求3所述的微生物功能菌群，其特征在于，先将各种微生物单独培养，当达到对数生长期时，再混合培养得到功能菌群。5.根据权利要求1所述的微生物功能菌群，其特征在于，菌株单独培养和混合菌群一起培养时的培养基均为添加0.1
‑
0.15g/L氯霉素的马铃薯葡萄糖培养基；培养条件均为：温度为25
‑
30℃，转速为150
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【专利技术属性】
技术研发人员：梁伊丽，刘学端，张双飞，孙崇然，邓燕，段镇淳，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：