反义寡核苷酸在制备治疗进行性家族性肝内胆汁淤积症2型药物中的应用制造技术

本发明专利技术提供一种反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸是一种经过化学修饰的短RNA序列，其分子式为：5

【技术实现步骤摘要】
反义寡核苷酸在制备治疗进行性家族性肝内胆汁淤积症2型药物中的应用


[0001]本专利技术涉及化学医药领域，具体涉及反义寡核苷酸在制备治疗ABCB11基因c.76+29T>G突变所致的进行性家族性肝内胆汁淤积症2型药物中的应用。

技术介绍

[0002]进行性家族性肝内胆汁淤积症2型(Progressive familial intrahepatic cholestasis type 2，PFIC2)是一种严重的常染色体隐性遗传疾病，是婴儿期常见的胆汁淤积症病因之一，由ABCB11(ATP binding cassette subfamily B member 11)基因突变引起的胆盐输出泵(Bile salt export pump，BSEP)功能受损而导致。BSEP是一种特异性表达于肝细胞毛细胆管面上的ATP结合转运蛋白，负责与胆汁酸盐结合，将胆盐逆浓度梯度主动转运至毛细胆管胆汁中。PFIC2以婴儿期起病的黄疸、伴严重的瘙痒，血清胆汁酸升高，吸收不良和发育迟缓为主要临床特征。BSEP功能异常后，肝细胞内蓄积的胆盐对细胞产生严重的持续性的破坏，进一步导致肝纤维化、终末期肝病、肝脏恶性肿瘤高发，约68％的患者在青春期前需肝移植。Stindt J等的研究发现，由于循环中的BSEP抗体，部分PFIC2患者接受肝移植后出现BSEP缺陷的复发。
[0003]到目前为止，熊去氧胆酸(UDCA)是胆汁淤积症最常用的药物之一，通过刺激毛细胆管外排泵增加胆汁外排，起到细胞保护的作用。但由于PFIC2患者为原发性肝细胞膜上BSEP缺陷，只能在部分ABCB11基因突变致BSEP仍有残余功能的患者中一定程度上减轻胆汁淤积症状，仍可能进展为肝衰竭需要肝移植。ABCB11基因c.76+29T>G变异主要是通过在变异位点产生一个新的外显子剪接增强子，而导致了外显子2和外显子3之间出现42bp内含子序列潴留，而影响BSEP的功能。在临床工作中发现，携带该变异的PFIC2患者对UDCA无效，故研究个体化的新治疗方法十分必要。
[0004]反义寡核苷酸(Antisense oligonucleotides,ASOs)为经化学修饰的短链寡核苷酸序列，可以通过反向平行互补的形式特异性地结合到前体mRNA上，达到基因沉默的目的。近几年，基于反义寡核苷酸的治疗方法已成功的开发并应用于脊髓性肌萎缩和杜氏肌营养不良的患者。因此，亟需一种反义寡核苷酸，用于治疗c.76+29T>G变异所致的进行性家族性胆汁淤积症。

技术实现思路

[0005]本专利技术针对现有技术中的不足，提供一种反义寡核苷酸。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]一种反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸是一种经过化学修饰的短RNA序列，其分子式为：5
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ACACGAUGCAGUGAGGGAAAAAAG
‑3’
；所述反义寡核苷酸经过硫代修饰；所述反义寡核苷酸两端各四个碱基经过2'
‑
O
‑
Methyl修饰。
[0008]本专利技术所述的反义寡核苷酸用于制备治疗进行性家族性肝内胆汁淤积症2型c.76
+29T>G突变的药物，所述反义寡核苷酸通过反向平行互补的形式特异性地结合到c.76+29T>G所致的异常前体mRNA上，沉默该段假外显子的翻译，促使正常胆盐输出泵(BSEP)的表达。
[0009]本专利技术的有益效果是：常用的治疗胆汁淤积症的药物通过刺激毛细胆管外排泵增加胆汁外排，起到细胞保护的作用，但是治疗效果并不理想。本专利技术提供一种磷酸骨架经过硫代修饰，两端各四个碱基经过2'
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O
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Methyl修饰的反义寡核苷酸，该对反义寡核苷酸(ASO)对体外HEK293细胞中Minigene的剪接影响的结果提示ASO能够有效的纠正c.76+29T>G变异引起的外显子2和外显子3之间的碱基潴留，这表明ASO通过反向平行互补的形式特异性地结合到c.76+29T>G所致的异常前体mRNA上，沉默该段假外显子的翻译，促使正常BSEP的表达。
附图说明
[0010]图1展示了ABCB11基因c.76+29T>G变异体外Minigene剪接报告结果；图中从左到右，从上到下依次为Minigene凝胶电泳图、凝胶电泳中野生型、c.76+29T>G转录本测序图；
[0011]图2为ASO干预后c.76+29T>G变异的Minigene凝胶电泳。
具体实施方式
[0012]实验试剂及材料：
[0013]1)细胞及质粒：人胚肾上皮细胞(HEK293细胞)、pSPL3质粒由南京医科大学附属儿童医院重点实验室提供；DH5α化学感受态细胞(诺唯赞，中国)；
[0014]2)反义寡核苷酸(ASO)：ASO单核苷酸序列由中国擎科公司合成并提供，以硫代修饰磷酸骨架，2'
‑
O
‑
Methyl修饰两端各四个碱基；
[0015]3)质粒的构建与提取：血液基因组DNA提取试剂盒、普通DNA产物纯化试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、Endo
‑
free质粒提取试剂盒(天根，中国)；限制内切酶BamH
ꢀⅠ
和Xho
ꢀⅠ
、10
×
K Buffer(TaKaRa，中国)；2
×
Pantan Max Master Mix，ClonExpress Entry One Step Cloning Kit、DL5000DNA Marker、10
×
Loading Buffer(诺唯赞，中国)；Agarose、Tryptone、Yeast Extract(Sigma，美国)；Gel red(BIOTIUM，美国)；Tris
‑
硼酸电泳缓冲液TBE(雷根生物，中国)；EDTA、NaCl、硼酸、50％甘油(上海久亿化学试剂有限公司，中国)；氨苄青霉素(上海生工公司，中国)；
[0016]4)细胞培养及转染：DMEM、FBS、0.25％Trypsin
‑
EDTA(1
×
)、1
×
PBS、Penicillin
‑
Streptomycin Liquid(Gibco，美国)；LipofectamineTM2000 Transfection Reagent(Invitrogen，美国)；无血清细胞冻存液(新赛美生物科技，中国)。
[0017]实施例1
[0018]ABCB11基因变异c.76+29T>G的生物信息学分析：根据ESEfinder 3.0的预测，变异c.76+29T>G位于内含子2，可能产生一个新的外显子剪接增强子而影响剪接。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种反义寡核苷酸，其特征在于，所述反义寡核苷酸是一种经过化学修饰的短RNA序列，其分子式为：5
’‑
ACACGAUGCAGUGAGGGAAAAAAG
‑3’
；所述反义寡核苷酸经过硫代修饰；所述反义寡核...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑玉灿，郑必霞，刘志峰，金玉，唐维兵，王春莉，周玮，胡国瑞，陆妍，
申请(专利权)人：南京市儿童医院，
类型：发明
国别省市：