一种特异性富集粪便中miRNA的探针、应用及方法技术

本发明专利技术创造提供了一种特异性富集粪便中miRNA的探针、应用及方法，所述探针为反义寡核苷酸探针，所述探针的3

【技术实现步骤摘要】
一种特异性富集粪便中miRNA的探针、应用及方法


[0001]本专利技术创造属于生物检测领域，尤其是涉及一种特异性富集粪便中miRNA的探针、应用及方法。

技术介绍

[0002]miRNA的提取方法主要分为两大类：1.提取样品中的总RNA后，通过 PAGE电泳或PEG将总RNA中的小片段RNA分离出来，最后对小片段的RNA进行沉淀回收，从而获得miRNA；2.在适宜的乙醇使用量下，特殊硅基质吸附材料可特异吸附小片段RNA（小于200 nt），经过洗脱最终得到miRNA溶液。而使用上述2种方法获取miRNA需要大量的纯化的RNA，但在样本稀缺时，这样的要求往往是无法实现的。
[0003]粪便样本成分复杂，粪便RNA提取中往往伴有RNA酶等RNA降解物、腐殖酸等等有机物的影响，得到的RNA纯度不高，浓度不够，导致下游实验如PCR、测序等实验数据不稳定；而通过本方法富集粪便中特异性miRNA可去除上述影响，得到的miRNA纯度高。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术创造旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种特异性富集粪便中miRNA的探针、应用及方法。
[0005]为达到上述目的，本专利技术创造的技术方案是这样实现的：本专利技术的第一方面提供了一种特异性富集粪便中miRNA的探针，所述探针为反义寡核苷酸探针，所述探针的3
’
端具有生物素修饰，所述探针序列如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：10中的任意一条序列或多条序列所示。
[0006]本专利技术的第二方面提供了一种复合磁珠反义寡核苷酸探针，包括上述探针以及包被有链霉亲和素的磁珠。
[0007]本专利技术的第三方面提供了一种上述复合磁珠反义寡核苷酸探针的制备方法，包括 如下步骤：（1）设计并合成反义寡核苷酸探针，其中3
’
端加生物素修饰，反义寡核苷酸探针的浓度为0.1
‑
10uM，95℃杂交，35
‑
37℃孵育；（2）将反义寡核苷酸探针混合液与包被有链霉亲和素的磁珠悬液混匀，室温下孵育得到磁珠探针复合物；（3）将孵育后的磁珠探针复合物用NaOH溶液清洗除去非特异性结合或游离的探针，然后用tt缓冲液重复清洗；（4）将清洗后的磁珠探针复合物加入到tt缓冲液中进行重悬后在80℃下孵育，除去液体中结合不稳定的偶联分子，最后用DEPC水清洗即可得到所需复合磁珠反义寡核苷酸探针。
[0008]优选的，当反义寡核苷酸探针为多种时，所述步骤（1）中将多种反义寡核苷酸探针按1：1的比例制成探针混合物，每种反义寡核苷酸探针的浓度为0.1
‑
10uM。
[0009]优选的，所述步骤（2）中反义寡核苷酸探针混合液与包被链霉亲和素的磁珠在混合过程中按照每10
‑
20pmol的反义寡核苷酸探针与1020μg 包被链霉亲和素的磁珠的比例进行混合。
[0010]优选的，所述步骤（3）和步骤（4）中的tt缓冲液为250mM的tris
‑
hcl缓冲液中加入0.1％的T20，并将pH调到8.0后得到。
[0011]本专利技术的第四方面提供了一种特异性富集粪便中miRNA的方法，包括如下步骤：S1：粪便样本预处理；S2：复合磁珠反义寡核苷酸探针预处理；S3：miRNA的捕获与纯化。
[0012]优选的，所述步骤S1的粪便样本的预处理的具体步骤为：取粪便样本于离心管中，加入PBS充分振荡混匀， 离心取上清液；再加入裂解液和蛋白酶K，55
‑
75℃孵育；90℃灭活，离心后，取上清。
[0013]优选的，所述步骤S2复合磁珠反义寡核苷酸探针预处理具体步骤为：S21：涡旋振荡重悬磁珠；S22：取10
‑
500ul磁珠到离心管中，加入室温的1
×
BW buffer；S23：将离心管置于磁力架上2
‑
5min，吸出上清；S24：加入室温的1
×
BW buffer重悬磁珠；S25：重复步骤S23
‑ꢀ
S24；S26：将离心管置于磁力架上2
‑
5min，吸出上清；S27：加入Buffer B清洗磁珠1次，将离心管置于磁力架上2min，吸出上清；S28：加入400μl 2
×ꢀ
B&W buffer重悬磁珠备用。
[0014]优选的，所述步骤S3的miRNA的捕获与纯化具体步骤为：S31：将步骤S2预处理后磁珠与步骤S1粪便样本处理后上清翻转结合10
‑
15min，置于磁力架上2
‑
5min，小心吸去上清；S32：加入wash buffer重悬磁珠，置于磁力架上1min,小心吸去上清，重复此步骤1次；S33：晾干磁珠，加入DEPC水混匀磁珠，加热洗脱2
‑
10min,置于磁力架上直到液体澄清，取上清即得所需miRNA；S34：进行浓度和纯度鉴定。
[0015]本专利技术的第四方面提供了一种特异性富集粪便中miRNA的试剂盒，包括上述探针或上述复合磁珠反义寡核苷酸探针。
[0016]相对于现有技术，本专利技术创造具有以下优势：使用本专利技术所述的探针样本用量少，可以进行特异性microRNA富集，提高提取效率，提高后续应用效果。
附图说明
[0017]图1为复合磁珠反义寡核苷酸探针的制备过程示意图；图2为miRNA的捕获与纯化过程示意图；图3为洗脱两次的实验结果；
图4为不同样本量提取结果；图5为引入特异性序列实验结果。
具体实施方式
[0018]除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本专利技术创造所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0019]下面结合实施例来详细说明本专利技术创造。
[0020]实施例1复合磁珠反义寡核酸探针制备过程如图1所示，包括如下步骤：（1）设计并合成10种反义寡核苷酸探针，其中3
’
端加生物素修饰，将10种反义寡核苷酸按1：1的比例制成探针混合物（每种反义寡核苷酸的浓度为1uM），95℃杂交5min，37℃孵育20min；（2）探针固定到磁珠上：将杂交后的探针混合物与链霉亲和素磁珠悬液混匀，室温下孵育（探针混合物与链霉亲和素磁珠在混合过程中按照每20pmol 探针与20μg 链霉亲和素磁珠的比例进行混合）；将孵育后的复合磁珠反义寡核酸探针液用NaOH(0.15m)溶液清洗除去非特异性结合或游离的探针，然后用tt缓冲液（250mM的tris
‑
hcl缓冲液中加入0.1％的T20，并将pH调到8.0）重复清洗，再将磁珠探针加入到tt缓冲液中进行重悬后在80℃下孵育10min，除去液体中结合不稳定的偶联分子，最后用DEPC水清洗即可得到所需复合磁珠反义寡核酸探针。
[0021]实施例22.1 标本来源5例轻度便潜血本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种特异性富集粪便中miRNA的探针，其特征在于：所述探针为反义寡核苷酸探针，所述探针的3
’
端具有生物素修饰，所述探针序列如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：10中的任意一条序列或多条序列所述。2.一种复合磁珠反义寡核苷酸探针，其特征在于：包括权利要求1所述的探针以及包被有链霉亲和素的磁珠。3.一种权利要求2所述的复合磁珠反义寡核苷酸探针的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）设计并合成反义寡核苷酸探针，其中3
’
端加生物素修饰，反义寡核苷酸探针的浓度为0.1
‑
10uM，95℃杂交，25
‑
37℃孵育，当反义寡核苷酸探针为多种时，所述步骤（1）中将多种反义寡核苷酸探针按1：1的比例制成探针混合物，每种反义寡核苷酸探针的浓度为0.1
‑
10uM；（2）将反义寡核苷酸探针混合液与包被有链霉亲和素的磁珠悬液混匀，室温下孵育得到磁珠探针复合物；（3）将孵育后的磁珠探针复合物用NaOH溶液清洗除去非特异性结合或游离的探针，然后用tt缓冲液重复清洗；（4）将清洗后的磁珠探针复合物加入到tt缓冲液中进行重悬后在80℃下孵育，除去液体中结合不稳定的偶联分子，最后用DEPC水清洗即可得到所需复合磁珠反义寡核苷酸探针。4.根据权利要求3所述的所述的复合磁珠反义寡核苷酸探针的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中反义寡核苷酸探针混合液与包被链霉亲和素的磁珠在混合过程中按照每10
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20pmol的反义寡核苷酸探针与10
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20μg 包被链霉亲和素的磁珠的比例进行混合。5.根据权利要求3所述的所述的复合磁珠反义寡核苷酸探针的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）和步骤（4）中的tt缓冲液为250mM的tris
‑
hcl缓冲液中加入0.1％的T20，并将pH调到8.0后得到。6.一种特异性富集粪便中miRNA的方法，其特征在于：包括如下步骤：S1：粪便样本预处...

【专利技术属性】
技术研发人员：常子嵩，安忠雪，李薇，
申请(专利权)人：来普天津生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：