一种用于真核基因表达的启动子及其载体和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于真核基因表达的启动子及其载体和应用。所述启动子具有如(I)、(II)或(III)所述的核苷酸序列中的任意一个：(I)编码RPS27启动子的核苷酸序列；(II)如(I)所述的核苷酸序列经修饰、取代或突变至少一个核苷酸获得的核苷酸序列；(III)与(I)所述的核苷酸序列具有≥90％同源性的核苷酸序列。本发明专利技术中提供的表达启动子不含潜在起始翻译序列，从根本上消除了非目的翻译起始；同时，所述启动子能够驱动外源基因的表达，利用其构建的表达载体在不同细胞中均能实现目的基因的高效表达，因此，该启动子在临床基因治疗领域具有广泛的应用前景。广泛的应用前景。广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种用于真核基因表达的启动子及其载体和应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，涉及一种真核基因表达启动子及其载体和应用。

技术介绍

[0002]真核基因的外源表达不仅是生命科学研究领域的基本基因操作手段，也是临床基因治疗用的主要策略。启动子(Promoter)是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列，它含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列，多数位于结构基因转录起始点的上游且本身不被转录。转录的起始是基因表达的关键阶段，而这一阶段的重要问题是RNA聚合酶与启动子的相互作用：启动子的结构影响了它与RNA聚合酶的亲和力，从而影响了基因表达的水平。
[0003]当前常见的进行外源基因过表的组成型表达启动子包括CMV、EF1a promoter和UBC promoter等。然而，这些启动子往往存在缺陷：(1)在不同种细胞类型中表达差异极大，比如CMV在胚胎干细胞ESC中活性很低；(2)UBC启动子的整体表达效率比CMV和EF1a启动子都要孱弱；(3)EF1a启动子虽然比较高效，但是启动子区域较大，转录调控因子不集中，为确保启动子活性，大片段的内含子区域被保留，在内含子中存在许多ATG序列，导致不正确的翻译起始，在clontech公司的慢病毒载体上EF1a启动子长达1kb有余，并且根据经验，EF1a启动子在长期培养中会被沉默。
[0004]因此，亟需寻找和遴选更加精简更加高效更加稳定的启动子，用于外源基因的表达研究。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供一种用于真核基因表达的启动子及其载体和应用，所述启动子能够在多种细胞中高效启动外源基因表达，且长度短，易于制备和应用，在临床基因治疗领域具有广泛的应用前景。
[0006]为达上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]第一方面，本专利技术提供一种用于真核基因表达的启动子，所述启动子具有如(I)、(II)或(III)所述的核苷酸序列中的任意一个：
[0008](I)编码RPS27启动子的核苷酸序列；
[0009](II)如(I)所述的核苷酸序列经修饰、取代或突变至少一个核苷酸获得的核苷酸序列；
[0010](III)与(I)所述的核苷酸序列具有≥90％同源性的核苷酸序列。
[0011]本专利技术从RNA
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seq以及ChIP
‑
seq数据入手，筛选得到了一种更优的真核基因表达启动子，长度相较于现有启动子较短，且非常适合用于基因工程操作。经研究发现，其具有与EF1a启动子相当的表达效率，并且在若干细胞类型中具有更高更稳定的表达强度，时间尺度的表达稳定性也明显优于EF1a启动子，由该启动子驱动外源基因表达为基因治疗提供了新的研究技术和工具，可有效应用于制备基因治疗药物领域。
[0012]优选地，所述编码RPS27启动子的核苷酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列。
[0013]SEQ ID NO.1：
[0014]CAACTGTCAAGGTATGGCACAAAATTTTAAAAGTGTCCATTTATCCCTGGATAGTGATCAAACGCTGACCTCAAATTAGCAAGGTAACCCTCTCAACATGGTGACGCATATGTGTCACAACTAACAGTTAAAGACCTTCCGAAAATGGCAGCTCCCTTGTCTCCCCACTGCGGCGGATCAAAGTAAGACGTTCCAAACATGGTGGCACAAGATCCTTGCGTCATTTCCTGTAGTGTGCTCTATATAAGGGGCAGGATTTCCGCTTTCGCTCCTTTCCGGCGGTGACGACCTACGCACACGAGAACATGCCTGTGAGTGCTTTGGTCCAGGTTTCGGCGGAGATCTCGCTGTTCTGTCCGAACTCTCCCCT。
[0015]优选地，所述启动子具有编码RPS27启动子的转录调控活性区的核苷酸序列或RPS27启动子的转录调控活性区经修饰、取代或缺失至少一个核苷酸获得的核苷酸序列。
[0016]本专利技术对RPS27启动子深入分析，截取RPS27启动子最具转录调控活性区域，能够得到明显缩短的高效启动子。
[0017]优选地，所述启动子的核苷酸序列包括SEQ ID NO.2所示的序列。
[0018]SEQ ID NO.2：
[0019]TCAAATTAGCAAGGTAACCCTCTCAACATGGTGACGCATATGTGTCACAACTAACAGTTAAAGACCTTCCGAAAATGGCAGCTCCCTTGTCTCCCCACTGCGGCGGATCAAAGTAAGACGTTCCAAACATGGTGGCACAAGATCCTTGCGTCATTTCCTGTAGTGTGCTCTATATAAGGGGCAGGATTTCCGCTTTCGCTCCTTTCCGGCGGTGACGACCTACGCACACGAGAAC。
[0020]本专利技术中，对RPS27启动子最具转录调控活性区域进行突变进化，设计得到更短的高效启动子。
[0021]优选地，所述启动子的核苷酸序列包括SEQ ID NO.3所示的序列。
[0022]SEQ ID NO.3：
[0023]CGGCGGATCAAAGTAAGACGTTCCAAACATGGTGGCACAAGATCCTTGCGTCATTTCCTGTAGTGTGCTCTATATAAGGGGCAGGATTTCCGCTTTCGCTCCTTTCCGGCGGTGACGACCTACGCACACGAGAACGTGCCTTTTCCGGCTTTGGTCCAGGTTTCGGCGGAGATCTCGCTGTTCTGTCCGAACTCTCCCCT。
[0024]本专利技术通过创造性设计，进一步得到长度短且具备高水平表达强度的用于真核基因表达的启动子。
[0025]第二方面，本专利技术提供一种表达载体，所述表达载体包含如第一方面所述的用于真核基因表达的启动子。
[0026]优选地，所述表达载体包括如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，所述表达载体还包括5
’
LTR、3
’
LTR、真核基因或WPRE调控元件中的任意一种或至少两种的组合。
[0027]第三方面，本专利技术提供一种重组细胞，所述重组细胞包含至少一个拷贝的如第二方面所述的表达载体。
[0028]优选地，所述重组细胞包括包含至少一个拷贝的如第二方面所述的表达载体的293T细胞、HEL细胞或MSC细胞中的任意一种或至少两种的组合。
[0029]第四方面，本专利技术提供如第一方面所述的用于真核基因表达的启动子、如第二方面所述的表达载体或第三方面所述的重组细胞在真核基因表达或制备基因治疗药物中的应用。
[0030]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0031](1)本专利技术提供了一种可用于本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于真核基因表达的启动子，其特征在于，所述启动子具有如(I)、(II)或(III)所述的核苷酸序列中的任意一个：(I)编码RPS27启动子的核苷酸序列；(II)如(I)所述的核苷酸序列经修饰、取代或突变至少一个核苷酸获得的核苷酸序列；(III)与(I)所述的核苷酸序列具有≥90％同源性的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的用于真核基因表达的启动子，其特征在于，所述编码RPS27启动子的核苷酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列。3.根据权利要求1或2所述的用于真核基因表达的启动子，其特征在于，所述启动子具有编码RPS27启动子的转录调控活性区的核苷酸序列或RPS27启动子的转录调控活性区经修饰、取代或缺失至少一个核苷酸获得的核苷酸序列。4.根据权利要求1～3任一项所述的用于真核基因表达的启动子，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列包括SEQ ID NO.2所示的序列。5.根据权利要求1～3任一项所述的用于真核基因表达的启动子，其特征在于，所述启动子的核...

【专利技术属性】
技术研发人员：张磊，王文天，张文慧，杨仁池，薛峰，池颖，李慧媛，
申请(专利权)人：中国医学科学院血液病医院中国医学科学院血液学研究所，
类型：发明
国别省市：