一种检测多种炎症因子的衬底及制备方法、试剂盒及应用技术

本发明专利技术属于分子生物学检测技术领域，公开了一种检测多种炎症因子的衬底及制备方法、试剂盒及应用，所述衬底上通过Lys

【技术实现步骤摘要】
一种检测多种炎症因子的衬底及制备方法、试剂盒及应用


[0001]本专利技术属于分子生物学检测
，特别涉及一种检测多种炎症因子的衬底及制备方法、试剂盒及应用。

技术介绍

[0002]炎症(inflammation)：就是平时人们所说的“发炎”，是机体对于刺激的一种防御反应。可以是感染引起的感染性炎症，也可以不是由于感染引起的非感染性炎症。通常情况下，炎症是有益的，是人体的自动防御反应，但是有的时候，炎症也是有害的，例如对人体自身组织的攻击、发生在透明组织的炎症等等，且炎症不仅仅局限于感染和创伤的病理生理过程。
[0003]近年来，随着对炎症因子的深入研究,发现炎症与多种疾病之间存在及其复杂的网络联系，例如动脉粥样硬化、高血压、心力衰竭、心梗、心衰、血液栓塞、心肌病以及由宿主反应失调导致的器官功能障碍的脓毒症等的发病过程都伴随着炎症因子的参与。其中，心血管疾病已经成为人们死亡的首要原因。脓毒症的死亡率已经超过心肌梗死，成为死亡率较高的疾病。因此，提前检测和干预此类疾病已经成为当前的首要问题。
[0004]炎症因子包含很多种，其中包括降钙素原(PCT)、白介素6(IL6)、C反应蛋白(CRP)、肌钙蛋白I(CTnI)、肌钙蛋白T(CTnT)、N末端脑钠肽前体(NT
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BNP)等。其中，PCT是用于检测细菌感染所致炎症反应的较好指标。IL6是一种炎症因子，感染反应发生后引起炎症反应，进而诱导PCT发生变化，但是对后续的监测效果较差。CRP在脓毒症感染后一定时间内升高，然后下降速度缓慢，对早期识别临床患者有利且其作为心肌梗死重要的预测因子之一，在临床上扮演着重要的角色。
[0005]迄今为止，检测炎症因子的方法得到了快速的发展。如:酶联免疫吸附法、化学发光免疫分析，电化学阻抗谱、电化学和表面增强拉曼光谱(SERS)等方法。酶联免疫吸附法所需大量实验试剂，样品处理复杂，成本高，且检测过程容易出现假阳性；电化学阻抗谱指的是给电化学系统施加小振幅的交流电势波，通过测量交流电势与电流信号的比值达到检测的目的。然而该方法体系不稳定，检测线性范围窄，限制于单一生物标志物的检测，诊断效率低，为临床带来了极大的不便。近年来，表面增强拉曼光谱方法凭借其较高的分子特异性、较低的样品消耗量以及快速无创伤受到了极大的欢迎。然而，该方法实验过程繁琐，检测物单一且实验过程中通过金银纳米颗粒的拉曼增强效果达到最终检测的目的，大大降低了工作效率。总的来说，虽然以往开发的方法具有很好的特异性，但是当检测物浓度是痕量时，检测的精度往往要求很高且临床往往需要几种标志物辅助检测达到识别病因的目的。因此，建立一种操作简单、线性范围宽、分析时间短、灵敏度高且满足同时检测方法多种样本是至关重要的。

技术实现思路

[0006]为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种检测多种炎症因子的衬底及制备方法、
试剂盒及应用，以达到可以快速、低成本、高灵敏度进行多种炎症因子的检测的目的。
[0007]为达到上述目的，本专利技术的技术方案如下：
[0008]一种检测多种炎症因子的衬底，所述衬底上通过Lys
‑
Au NPs@MoS2纳米复合材料固定有多种重组蛋白捕获抗体条形码。
[0009]上述方案中，所述多种重组蛋白捕获抗体条形码重复排列。
[0010]一种如上所述的检测多种炎症因子的衬底的制备方法，包括如下步骤：
[0011]步骤一，纳米复合材料溶液的制备以及基片的前处理：
[0012]所述纳米复合材料溶液的制备包括如下过程：
[0013](1)将MoS2纳米溶液超声处理备用，然后将Tween20，HAuCl4·
H2O和柠檬酸钠加入超声处理后的MoS2纳米溶液中，剧烈搅拌在温度为70
‑
90℃条件下反应20
‑
60分钟；
[0014](2)离心纯化得到AuNPs@MoS2纳米复合材料，并将其分散在超纯水中；
[0015](3)将配置好的Lys水溶液与AuNPs@MoS2纳米复合材料溶液混合，常温下搅拌，过夜放置，得到Lys
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Au NPs@MoS2纳米复合材料溶液；
[0016]所述基片的前处理包括如下过程：
[0017](1)将基片在食人鱼溶液中煮沸后，再用去离子水进行超声清洗；
[0018](2)将清洗过的基片采用等离子体清洗机进行表面处理；
[0019](3)将等离子体清洗机处理过的基片用APTMS处理，然后用去离子水超声清洗并吹干；
[0020]步骤二，基片上生长纳米复合材料：
[0021]将APTMS处理后的基片置于Lys
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Au NPs@MoS2纳米复合材料溶液中，一段时间后取出，用去离子水超声清洗并吹干，得到纳米复合材料功能化衬底；
[0022]步骤三，制备条形码铺设芯片：
[0023]利用光刻技术在硅基底上制备条形码铺设芯片模板，将PDMS与固化剂均匀铺到模板中，放入烘箱中，60
‑
85℃烘烤10
‑
30分钟后，从烘箱中取出，在室温下放置一段时间；从模板上将制备好的条形码铺设芯片揭下，制得的条形码铺设芯片上开设有多个进样孔、多个出样孔以及多条平行的流道，每条所述流道的两端分别连通一个进样孔和一个出样孔；
[0024]步骤四，重组蛋白捕获抗体与纳米复合材料功能化衬底的固定结合：
[0025]将制得的条形码铺设芯片与步骤二得到的纳米复合材料功能化衬底结合，通过重力贴合在一起；向每个进样孔中加入不同的重组蛋白捕获抗体，使其在流道中与纳米复合材料功能化衬底上的Lys
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Au NPs@MoS2纳米复合材料结合，15
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50分钟后冲洗流道移除多余的捕获抗体，然后将条形码铺设芯片揭下，并吹干纳米复合材料功能化衬底，至此，固定有多种重组蛋白捕获抗体条形码的衬底制备完成。
[0026]一种检测多种炎症因子的试剂盒，包括如上所述的衬底、检测样本加载芯片、生物素标记的多种单克隆检测抗体、APC标记的链霉亲和素、工作液和多种抗原。
[0027]上述方案中，所述衬底上的重组蛋白捕获抗体包括CRP、CTnI、CTnT、PCT、IL6和NT
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BNP重组蛋白捕获抗体，所述多种单克隆检测抗体包括CRP、CTnI、CTnT、PCT、IL6和NT
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BNP单克隆检测抗体，所述多种抗原包括CRP、CTnI、CTnT、PCT、IL6和NT
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BNP抗原。
[0028]上述方案中，所述检测样本加载芯片采用PDMS材料制备，其上开设多个上下贯穿的检测微腔。
[0029]上述方案中，所述工作液是BSA的DPBS溶液，BSA的质量占DPBS溶液的体积比例为1％，所述工作液的pH为7.2
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7.4，浓度为0.01mol/L。
[0030]一种如上所述的检测多种炎症本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测多种炎症因子的衬底，其特征在于，所述衬底上通过Lys
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Au NPs@MoS2纳米复合材料固定有多种重组蛋白捕获抗体条形码。2.根据权利要求1所述的一种检测多种炎症因子的衬底，其特征在于，所述多种重组蛋白捕获抗体条形码重复排列。3.一种如权利要求1所述的检测多种炎症因子的衬底的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，纳米复合材料溶液的制备以及基片的前处理：所述纳米复合材料溶液的制备包括如下过程：(1)将MoS2纳米溶液超声处理备用，然后将Tween20，HAuCl4·
H2O和柠檬酸钠加入超声处理后的MoS2纳米溶液中，剧烈搅拌在温度为70
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90℃条件下反应20
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60分钟；(2)离心纯化得到AuNPs@MoS2纳米复合材料，并将其分散在超纯水中；(3)将配置好的Lys水溶液与AuNPs@MoS2纳米复合材料溶液混合，常温下搅拌，过夜放置，得到Lys
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Au NPs@MoS2纳米复合材料溶液；所述基片的前处理包括如下过程：(1)将基片在食人鱼溶液中煮沸后，再用去离子水进行超声清洗；(2)将清洗过的基片采用等离子体清洗机进行表面处理；(3)将等离子体清洗机处理过的基片用APTMS处理，然后用去离子水超声清洗并吹干；步骤二，基片上生长纳米复合材料：将APTMS处理后的基片置于Lys
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Au NPs@MoS2纳米复合材料溶液中，一段时间后取出，用去离子水超声清洗并吹干，得到纳米复合材料功能化衬底；步骤三，制备条形码铺设芯片：利用光刻技术在硅基底上制备条形码铺设芯片模板，将PDMS与固化剂均匀铺到模板中，放入烘箱中，60
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85℃烘烤10
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30分钟后，从烘箱中取出，在室温下放置一段时间；从模板上将制备好的条形码铺设芯片揭下，制得的条形码铺设芯片上开设有多个进样孔、多个出样孔以及多条平行的流道，每条所述流道的两端分别连通一个进样孔和一个出样孔；步骤四，重组蛋白捕获抗体与纳米复合材料功能化衬底的固定结合：将制得的条形码铺设芯片与步骤二得到的纳米复合材料功能化衬底结合，通过重力贴合在一起；向每个进样孔中加入不同的重组蛋白捕获抗体，使其在流道中与纳米复合材料功能化衬底上的Lys
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Au NPs@MoS2纳米复合材料结合，15
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50分钟后冲洗流道移除多余的捕获...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩琳，邱教艳，张宇，王春华，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：