一种检测T2毒素的CRISPR-Cas14a响应型光电化学传感检测方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种检测T2毒素的CRISPR

【技术实现步骤摘要】
一种检测T2毒素的CRISPR
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Cas14a响应型光电化学传感检测方法和试剂盒


[0001]本专利技术涉及小分子毒素检测领域，特别是涉及一种检测T2毒素的CRISPR
‑
Cas14a响应型光电化学传感检测方法和试剂盒。

技术介绍

[0002]T2毒素是自然界中镰刀菌分泌的A型毛霉烯中毒性最强的毒素之一，广泛存在于玉米、小麦等食品中。T2毒素痕量致毒，进入人体后会在肝脏、脑、生殖系统等多个器官引起毒性效应。因此，开发针对T2毒素的超灵敏和稳定性强的检测策略具有重要意义。
[0003]目前大部分基于CRISPR
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Cas系统的传感器都以荧光作为输出信号。而相较于荧光信号，电信号具更好的性价比和便携特性。近来，光电化学(PEC)作为一种光化学与电化学相结合的新型分析工具得到了广泛的发展。其主要原理是光照射下光活性材料上发生的电子
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空穴对的分离和电荷转移导致光电信号的转换，而相应的光电流会受到电子供体/受体的显著影响。基于光电化学的生物传感平台具有信号读出速度快、操作简单，灵敏度高等优点，但是准确性是限制光电化学生物传感的关键因素之一。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种用于检测T2毒素的CRISPR
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Cas14a响应型上转换光电化学传感检测方法和试剂盒，以解决上述现有技术存在的问题，本专利技术利用SDA等温扩增放大信号，Cas14a反式切割特性和光电信号对目标物进行检测，提高了检测稳定性、特异性强和灵敏度。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0006]本专利技术提供一种检测T2毒素的CRISPR
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Cas14a响应型光电化学传感检测方法和试剂盒，包括以下步骤：
[0007](1)磁性探针的制备：磁珠与T2
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APT混合，制备成磁性探针；
[0008](2)电极修饰：ITO玻璃经超声清洗后，利用电化学沉积方法制备得到CdS
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Au/ITO电极；巯基修饰的DNA
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UCNPs与TCEP混合还原后，再与所述CdS
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Au/ITO电极反应，得到CdS
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Au
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UCNPs/ITO电极；
[0009](3)磁珠的识别：所述磁性探针重悬后加入T2
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APT，孵育结合，然后加入互补的T2
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cDNA和目标物进行竞争，通过磁分离获得竞争出的cDNA；
[0010](4)SDA等温扩增：不同浓度的步骤(3)获得的cDNA经SDA等温扩增得到不同浓度cDNA对应的ssDNA；
[0011](5)切割步骤：Cas 14a和sgRNA孵育形成Cas 14a
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sgRNA复合物，再加入不同浓度cDNA对应的步骤(4)得到的ssDNA，得到混合溶液，再让所述CdS
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Au
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UCNPs/ITO电极在所述混合溶液中浸泡或将所述混合溶液滴加到电极表面，然后在37℃条件下静置1h；
[0012](6)光电化学检测：采用三电极体系，以步骤(5)静置后的CdS
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Au
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UCNPs/ITO电极
为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，Pt片电极为辅助电极，以980nm为激发光源，采用电流
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时间曲线法进行光电化学检测；
[0013](7)制作标准曲线：将所述光电化学检测测得的吸光度值为纵坐标，T2毒素浓度为横坐标制作标准曲线。
[0014]进一步地，在步骤(1)中，所述磁性探针的制备方法包括：取100μL磁珠经磁性分离和洗涤后，加入500μLT2
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APT，在室温条件下混合30min。
[0015]进一步地，在步骤(2)中，所述CdS
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Au/ITO电极的制备方法包括：ITO玻璃经超声清洗后，以CdS和Na2S2O3溶液为电解液，用循环伏安法在ITO玻璃表面沉积CdS纳米粒子，得到CdS/ITO电极，将所述CdS/ITO电极放入到Au/ITO的制备液中，制备得到所述CdS
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Au/ITO电极。
[0016]进一步地，在步骤(3)中，所述SDA等温扩增包括以下操作：TemDNA和不同浓度的步骤(3)获得的cDNA于95℃加热5min后缓慢冷却至室温，降温退火过程持续2h；再加入CutSmart缓冲液，dNTP，Klenow Fragment酶，混匀并在37℃反应15min；再加入Nt.BsmAI酶，混合均匀，置于37℃3h，之后灭酶，得到ssDNA。
[0017]进一步地，在步骤(5)中，所述孵育的反应条件为：37℃，10min。
[0018]进一步地，在步骤(6)中，电解液为无水0.1M PBS和0.01M抗坏血酸。
[0019]本专利技术还提供一种检测T2毒素的CRISPR
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Cas14a响应型光电化学传感检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下组分：磁性探针、CdS
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Au
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UCNPs/ITO电极、Ag/AgCl电极、Pt片电极、T2
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cDNA、SDA等温扩增体系、Cas 14a和sgRNA；
[0020]所述磁性探针由磁珠与T2
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APT混合制备而成；
[0021]所述CdS
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Au
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UCNPs/ITO电极的制备方法包括：ITO玻璃经超声清洗后，利用电化学沉积方法制备得到CdS
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Au/ITO电极；巯基修饰的DNA
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UCNPs与TCEP混合还原后，再与所述CdS
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Au/ITO电极反应，得到所述CdS
‑
Au
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UCNPs/ITO电极；
[0022]所述T2
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APT的序列为SEQ ID NO：1所示序列；所述T2
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cDNA的序列为SEQ ID NO：2所示序列；所述sgRNA的序列为SEQ ID NO：3所示序列。
[0023]本专利技术还提供上述的检测方法或试剂盒在检测T2毒素中的应用。
[0024]CRISPR
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Cas14a在靶向核酸方面的准确性可以弥补光电化学生物传感的缺点。为进一步提高光电信号的准确性和灵敏性，我们使用光毒性和背景值低的近红外(NIR)光作为光源代替传统的可见光/紫外光。因此，具有光稳定性和长荧光寿命的上转换纳米材料被引入作为近红外光的吸收介质。在此基础上，设计的电极工作原理主要是将UCNPs、Au和CdS的光学特性相互匹配。当980nm近红外光照射到电极表面时，UCNPs被激发并发射550nm波长的光。UCNPs发射的光通过荧光共振能量转移(FRET)将能量转移到本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测T2毒素的CRISPR
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Cas14a响应型光电化学传感检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)磁性探针的制备：磁珠与T2
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APT混合，制备成磁性探针；(2)电极修饰：ITO玻璃经超声清洗后，利用电化学沉积方法制备得到CdS
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Au/ITO电极；巯基修饰的DNA
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UCNPs与TCEP混合还原后，再与所述CdS
‑
Au/ITO电极反应，得到CdS
‑
Au
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UCNPs/ITO电极；(3)磁珠的识别：所述磁性探针重悬后加入T2
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APT，孵育结合，然后加入互补的T2
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cDNA和目标物进行竞争，通过磁分离获得竞争出的cDNA；(4)SDA等温扩增：不同浓度的步骤(3)获得的cDNA经SDA等温扩增得到不同浓度cDNA对应的ssDNA；(5)切割步骤：Cas 14a和sgRNA孵育形成Cas 14a
‑
sgRNA复合物，再加入不同浓度cDNA对应的步骤(4)得到的ssDNA，得到混合溶液，再让所述CdS
‑
Au
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UCNPs/ITO电极在所述混合溶液中浸泡或将所述混合溶液滴加到电极表面，然后在37℃条件下静置1h；(6)光电化学检测：采用三电极体系，以步骤(5)静置后的CdS
‑
Au
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UCNPs/ITO电极为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，Pt片电极为辅助电极，以980nm为激发光源，采用电流
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时间曲线法进行光电化学检测；(7)制作标准曲线：将所述光电化学检测测得的吸光度值为纵坐标，T2毒素浓度为横坐标制作标准曲线。2.根据权利要求1所述的检测T2毒素的CRISPR
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Cas14a响应型光电化学传感检测方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述磁性探针的制备方法包括：取100μL磁珠经磁性分离和洗涤后，加入500μLT2
‑
APT，在室温条件下混合30min。3.根据权利要求1所述的检测T2毒素的CRISPR
‑
Cas14a响应型光电化学传感检测方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述CdS
‑
Au/ITO电极的制备方法包括：ITO玻璃经超声清洗后，以CdS和Na2S2O3溶液为电解液，用循环伏安法在ITO玻璃表面沉积CdS纳米粒子，...

【专利技术属性】
技术研发人员：王瑜，高志贤，韩铁，周焕英，彭媛，李双，韩殿鹏，任舒悦，秦康，
申请(专利权)人：军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所，
类型：发明
国别省市：