一种减毒沙门氏菌分泌表达NTD结构域蛋白的新型冠状病毒疫苗抗原递呈系统及其应用技术方案

本发明专利技术公开了一种减毒沙门氏菌分泌表达NTD结构域蛋白的新型冠状病毒(SARS

【技术实现步骤摘要】
一种减毒沙门氏菌分泌表达NTD结构域蛋白的新型冠状病毒疫苗抗原递呈系统及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种针对NTD结构蛋白的、可用作新型冠状病毒疫苗表达载体的构建和重组减毒沙门氏菌的制备及其应用。

技术介绍

[0002]由严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)引起的2019年冠状病毒疾病(COVID-19)大流行是一个世纪以来人类面临的最严峻挑战，截至2020年9月1日，累计感染超过2700万人，并造成超过80万人的死亡。这种新型冠状病毒与2003年爆发的SARS冠状病毒(SARS-CoV)的基因组有约82％相似度，两种冠状病毒也共享相同的细胞受体，即血管紧张素转换酶2(ACE2)(Lan J等人,2020,Nature 581:215-220.)。尽管存在这些相似之处，新型冠状病毒比SARS病毒扩散得更广泛，更快速，也更致命(Zhu N等人,2020,N Engl J Med,382:727-733.)。因此，为了有效地防治新型冠状病毒的传播，人们急需开发出一种安全、高效、廉价的SARS-CoV-2疫苗。在早期针对SARS-CoV疫苗的开发过程中，研究人员发现针对病毒刺突蛋白(S蛋白)的抗体能高效的中和病毒并预防感染(Yang ZY等人,2005,Proc Natl Acad Sci U S A102:797-801.)，因此针对SARS-CoV-2的S蛋白是当下抗病毒药物及疫苗开发的首要靶点(Walls AC等人,2020,Cell 181:281-292.e6.)。
[0003]现阶段已有多家研究所与制药公司在快速开发新型冠状病毒疫苗，涉及减毒活疫苗、重组病毒载体疫苗、灭活病毒疫苗、蛋白亚基疫苗、病毒样颗粒(VLP)疫苗以及核酸疫苗等多种类型(Jeyanathan M等人,2020,Nat Rev Immunol 20:615-632.)。尽管减毒活疫苗显示出较高的保护力，但也伴随着高风险；灭活疫苗、重组病毒疫苗和核酸疫苗面临费用高昂，接种不便等问题；而直接接种传统的重组蛋白疫苗因不能很好的激起细胞免疫反应，而无法提供较好的保护效果，往往需要额外佐剂的添加(Guy B等人,2007,Nat Rev Microbiol 5:505-517.)。迄今为止，国内外所有研发的疫苗都是通过注射给药，目前国际上已经多个国家报道了新冠疫苗的副作用，甚至有出现死亡案例的报道。注射给药是最为直接的给药途径，但是也是所有给药途径中风险最高、成本最大的给药方式。迄今为止，在新冠疫苗的研发中还缺乏其他更为方便和安全的给药方式或给药途径。
[0004]疫苗的工作原理是：当疫苗抗原接种到动物机体后，刺激动物机体免疫系统，动物机体的抗原提呈细胞将疫苗进行处理、加工和递呈给特异性淋巴细胞(T和B淋巴细胞)，然后淋巴细胞对疫苗的识别、活化、增殖、分化最后产生免疫效应分子(抗体和细胞因子)及免疫效应细胞，并最终将抗原从动物机体中清除，这个过程称为免疫应答。由此可见，目前国际上普遍的新型冠状病毒疫苗研发中注射抗原的给药方式，很可能导致注射的抗原在全身组织中可能产生一些副作用，其发挥疫苗引发免疫的过程实际上是通过抗原提呈细胞产生的。因此，如果将抗原限制在抗原提呈细胞中产生，就有可能限制抗原在全身组织中可能产生的副作用，达到更安全的目标。
[0005]基于减毒菌株的口服疫苗因接种简单，价格低廉等优势，广泛的应用于多种感染
性疾病的疫苗开发。减毒沙门氏菌作为一种应用广泛的细菌口服疫苗载体，同时也是一种天然的粘膜免疫佐剂、抗原表达和投递工具。通过基因工程改造的重组疫苗株，经口服后通过肠道中M细胞进入机体内部(Jensen VB等人,1998,Infect Immun 66:3758-3766.)，进入体内环境的菌株可被抗原呈递细胞(APC)所快速吞噬处理，此时若借助菌体的分泌系统便可有效地将抗原蛋白分泌至APC细胞内部，进一步被有效分解成多肽段并通过组织相容性复合体MHC-I或MHC-II途径展示给辅助T细胞(T-help cell)，以激发机体产生针对抗原分子的细胞、体液以及粘膜免疫应答(Mei Y等人,2017,Cancer Immunol Res 5:503-514.)。
[0006]但是开发一种用于预防新冠病毒的高效且应用性强的口服减毒沙门氏菌疫苗，仍面临以下技术难题：a)维持重组细菌的表型稳定性，利用减毒细菌作为外源抗原的表达工具，需要建立一种合适的表达策略，以优化抗原表达量与质粒兼容性，否则会出现菌株毒性过高，工程质粒丢失严重而丧失免疫效果等问题；b)抗原蛋白经菌体分泌至细胞中的有效性，因为多数细菌在进入抗原递呈细胞后，会被一种膜包裹的囊泡结构(SCV)所包裹，这种结构在很大程度的限制了抗原分子的有效递呈(Zhang XL等人,2008,Cell Mol Immunol 5:91-7.)，若不能实现真正的有效呈递，将大大降低疫苗的预防效果；c)选用怎样的启动子，使得抗原分子只在抗原递呈细胞中表达，而不在血液和正常组织中表达，提供抗原分子的安全性。d)病毒抗原表位筛选与区域选择的最优性，由于新冠病毒S蛋白分子量大且结构复杂(Hsieh CL等人,2020,Science 369:1501-1505.)，需要针对其多个结构域不同表位进行筛选，以避免过于复杂的蛋白结构无法被有效分泌，并通过尽可能多的呈递有效抗原决定簇来诱导产生更佳的免疫应答。
[0007]因此，要获得一个高效的基于减毒沙门氏菌分泌表达系统的(SARS-CoV-2)新冠病毒疫苗，必须构建一个安全、高效且稳定的沙门氏菌分泌表达载体，以实现抗原分子在沙门氏菌中的表达并可有效分泌至抗原呈递细胞内，以高效诱导机体免疫应答，这是本专利技术要解决的问题。
[0008]由于不同的蛋白质具有不同的一级序列导致不同蛋白质的疏水性质和电荷分布差异很大、而不同蛋白质的不同的一级序列又导致不同蛋白质具有不同的空间结构或高级结构从而导致蛋白质的空间构型以及蛋白质表面的物理和化学性质差异很大。
[0009]因此，要实现不同抗原蛋白质在沙门氏菌中的高效、稳定、分泌的表达是异常困难的，无法预测或推断的，需要依照不同的蛋白质进行逐一研究、探索的，需要付出创造性的劳动。

技术实现思路

[0010]本专利技术的主要目的是构建一种减毒沙门氏菌分泌表达NTD结构域蛋白的新型冠状病毒疫苗抗原递呈系统，并筛选出能够诱导最佳免疫应答的新冠病毒抗原表位组合，从而为建立表达稳定、保护性效率高的以减毒沙门氏菌为运输载体的新型冠状病毒口服疫苗奠定基础。
[0011]为了达到上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：本专利技术的一种减毒沙门氏菌分泌表达NTD结构域蛋白的新型冠状病毒疫苗抗原递呈系统，所述的减毒沙门氏菌分泌表达NTD结构域蛋白的新型冠状病毒疫苗递呈系统包括III型分泌系统启动子序列和信号肽序列；能够通过减毒沙门氏菌实现新型冠状病毒抗原在抗原递呈细胞中的分泌表达，在小鼠
模型中诱导机体产生高效价抗体。
[0012]进一步地，利用抗原递呈本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种减毒沙门氏菌分泌表达NTD结构域蛋白的新型冠状病毒疫苗递呈系统，其特征在于：所述的减毒沙门氏菌分泌表达NTD结构域蛋白的新型冠状病毒疫苗递呈系统包括III型分泌系统启动子序列和信号肽序列；能够通过减毒沙门氏菌实现新型冠状病毒抗原在抗原递呈细胞中的分泌表达，在小鼠模型中诱导机体产生高效价抗体。2.根据权利要求1所述的减毒沙门氏菌分泌表达NTD结构域蛋白的新型冠状病毒疫苗抗原递呈系统，其特征在于：利用抗原递呈细胞胞内诱导型启动子调控细菌分泌信号分泌表达的抗原，利用沙门氏菌分泌表达系统使抗原能够获得分泌，添加质粒防丢失元件提高表达载体在沙门氏菌内的质粒稳定性，从而获得高效、稳定的、抗原递呈细胞胞内调控的减毒沙门氏菌分泌表达的抗原递呈系统。3.根据权利要求1所述的减毒沙门氏菌分泌表达NTD结构域蛋白的新型冠状病毒疫苗抗原递呈系统，其特征在于：新型冠状病毒疫苗抗原是经过筛选的、能诱导最佳免疫应答的新冠病毒抗原表位组合。4.根据权利要求3所述的减毒沙门氏菌分泌表达NTD结构域蛋白的新型冠状病毒疫苗抗原递呈系统，其特征在于：所述的能诱导最佳免疫应答的新冠病毒抗原表位组合为SARS-CoV-2刺突蛋白NTD结构域，位于S蛋白整体氨基酸序列的13-303位氨基酸，所述SARS-CoV-2刺突蛋白NTD结构域的基因序列为SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。5.根据权利要求1所述的减毒沙门氏菌分泌表达NTD结构域蛋白的新型冠状病毒...

【专利技术属性】
技术研发人员：华子春，吴乐阳，李霖，
申请(专利权)人：常州南京大学高新技术研究院，
类型：发明
国别省市：