希瓦氏菌株代谢乙酸盐改造方法及应用技术

本发明专利技术涉及希瓦氏菌株代谢乙酸盐改造方法及应用，将G.sulfurreducens中乙酸盐利用代谢途径的关键基因Ato1和Ato2引入S.oneidensis MR

【技术实现步骤摘要】
希瓦氏菌株代谢乙酸盐改造方法及应用


[0001]本专利技术属于基因工程和生物代谢
具体而言，是通过构建重组质粒以改造希瓦氏菌的代谢通路，拓宽其底物利用范围。使希瓦氏菌由摄取高价值乳酸作为碳源，转变为可利用低廉乙酸盐作为唯一碳源进行生长代谢和能源生产。

技术介绍

[0002]希瓦氏菌(Shewanella oneidensis)是一种常见的电活性微生物，其能够摄取利用环境中的有机物作为电子供体，经过胞内中心碳代谢循环产生电子并传递给胞内电子池，随后在一系列脱氢酶的作用下，电子汇入细胞内膜的醌池中，经过膜上胞外电子传递系统
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金属还原Mtr途径，最终传递至胞外电子受体，完成放电过程。由于希瓦氏菌特殊的电子传递能力，以希瓦氏菌S.oneidensis MR
‑
1为基础的微生物燃料电池系统被广泛应用于生物放电、化学品生产、环境修复等绿色能源方面。
[0003]微生物燃料电池可以通过电活性微生物从环境废弃物、工业废水、海洋沉积物中获取生物质以产生电能，这在污染物降解和可持续能源领域方面具有重要前景。乙酸盐作为工业废水和木质纤维素生物质水解物的主要成分，因其具有与糖类碳源竞争的潜力，在生物制造方面受到了广泛关注。因此，如何利用电活性微生物电催化系统将乙酸转化为可持续利用的绿色能源逐渐成为研究热点。在S.oneidensis中，乙酸盐通常通过以下两种途径完成代谢过程：
①
由AckA和Pta编码的乙酸激酶磷酸转乙酰酶途径；
②
由Acs编码的乙酰辅酶A合成酶途径。两者都需要消耗大量ATP来驱动。但在微生物燃料电池这种厌氧条件下由于ATP产生有限，S.oneidensis细胞不能通过该途径正常代谢乙酸。
[0004]据报道，在厌氧菌硫还原地杆菌(Geobacter sulfurreducens)中，乙酸盐通过琥珀酰辅酶A:乙酰辅酶A转移酶(succinyl
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CoA:acetate CoA
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transferase，SCACT)途径无需消耗ATP则可有效地将乙酸转化为乙酰辅酶A，而进入中心碳代谢循环。因此，针对G.sulfurreducens的无耗能乙酸代谢途径，我们通过大量文献检索结合实验结果分析，进一步筛选确定了在该途径中的两个关键基因，乙酰辅酶A转移酶(Ato1和Ato2)，负责将乙酸转化为乙酰辅酶A，而不需要过多的能量消耗。
[0005]因此，为了提高厌氧条件下的S.oneidensis乙酸代谢效率，我们引入了来自G.sulfurreducens SCACT途径中的关键基因(Ato1和Ato2)，增强乙酸的摄取率和乙酰辅酶A的转化率。同时，为了进一步提高乙酸的代谢循环效率，我们强化了S.oneidensis本源的乙酰辅酶A进入三羧酸循环的关键基因柠檬酸合酶GltA。最终，首次构建了能够利用乙酸为唯一碳源进行生长代谢并且高效产电的希瓦氏菌工程菌株。

技术实现思路

[0006]本专利技术旨在通过异源表达技术，结合基因工程等手段，将G.sulfurreducens中乙酸盐利用代谢途径(SCACT)的关键基因(Ato1和Ato2)引入S.oneidensis MR
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1中，并同时强化希瓦氏菌自身乙酸代谢通路中的关键基因GltA。使得最终工程改造后的希瓦氏菌能够在
以乙酸盐为唯一碳源的环境中进行生长代谢并高效放电。
[0007]本专利技术的技术方案概述如下：
[0008]希瓦氏菌株代谢乙酸盐改造方法，将G.sulfurreducens中乙酸盐利用代谢途径的关键基因Ato1和Ato2引入S.oneidensis MR
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1中，并同时强化希瓦氏菌自身乙酸代谢通路中的关键基因GltA；将三个基因Ato1，Ato2和GltA连接到载体质粒pYYDT上形成重组质粒，得到一个含有重组质粒的工程希瓦氏菌株，重组质粒的核苷酸序列为SEQ ID NO.5。
[0009]所述的基因Ato1核苷酸序列为SEQ ID NO.1。
[0010]所述的基因Ato2核苷酸序列为SEQ ID NO.2。
[0011]所述的基因GltA核苷酸序列为SEQ ID NO.3。
[0012]所述的方法，其特征是，载体质粒pYYDT核苷酸序列为SEQ ID NO.4。
[0013]本专利技术方法得到的代谢重组希瓦氏菌株用于在厌氧条件下代谢乙酸盐。
[0014]本专利技术方法得到的代谢重组希瓦氏菌株用于在以乙酸盐为唯一电子供体的微生物燃料电池中放电。
[0015]具体说明如下：
[0016]在NCBI数据库中查找G.sulfurreducens中乙酸盐摄取途径SCACT的关键基因Ato1和Ato2序列信息(如SEQ ID NO.1
‑
2所示)，S.oneidensis中促进TCA循环和乙酸盐代谢过程的关键基因GltA(如SEQ ID NO.3所示)，连接到载体质粒pYYDT(质粒图谱见图1A所示，序列信息如SEQ ID NO.4所示)，最终得到一个pYYDT上连有三个基因(Ato1，Ato2，GltA)的重组质粒，命名为pAU3，该质粒图谱如图1B所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0017]Ato1：来自Geobacter sulfurreducens中的琥铂酰辅酶A:乙酰辅酶A转移酶基因；
[0018]Ato2：来自Geobacter sulfurreducens中的琥铂酰辅酶A:乙酰辅酶A转移酶基因；
[0019]GltA：来自Shewanella oneidensis中的柠檬酸合酶基因。
[0020]本专利技术将上述经过密码子优化后的基因通过tac启动子和T1终止子完成表达，采用Biobrick的构建策略，利用SpeI与XbaI酶是同尾酶，经过处理后留下相同的粘性末端，在T4连接酶的作用下将所需要的外源基因逐个连接到基础质粒上，并且保证已连接的外源基因不受后续内切酶的影响。
[0021]所选重组质粒扩增的工程菌为营养缺陷型菌株E.coil WM3064(市售可得)，最终宿主工程菌为S.oneidensis MR
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1，WM3064的转化方法可采用化转方式将重组质粒直接转入E.coil WM3064细胞中，经接合转移到MR
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1菌中，得到最终构建的希瓦氏工程菌。导入pYYDT空质粒的对照组野生型菌株命名为WT，导入重组质粒(pAU3)的工程菌株命名为Ace
‑
3。
[0022]本专利技术通过上述的构建方法，重构S.oneidensis MR
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1的代谢通路，使工程希瓦氏菌能够在以乙酸盐为唯一碳源的SBM液体培养基中进行生长代谢，从而拓宽希瓦氏菌的可用底物谱。在厌氧条件下，WT菌株几乎不能代谢乙酸盐，而工程菌株具有显着的生长优势，Ace
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3的生长速率与有氧条件相似，并以0.23mM/h的速率消本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.希瓦氏菌株代谢乙酸盐改造方法，其特征是，将G.sulfurreducens中乙酸盐利用代谢途径的关键基因Ato1和Ato2引入S.oneidensis MR
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1中，并同时强化希瓦氏菌自身乙酸代谢通路中的关键基因GltA；将三个基因Ato1，Ato2和GltA连接到载体质粒pYYDT上形成重组质粒，得到一个含有重组质粒的工程希瓦氏菌株，重组质粒的核苷酸序列为SEQ ID NO.5。2.如权利要求1所述的方法，其特征是，基因Ato1核苷酸序列为...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋浩，由紫暄，李锋，尹静，陈正，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：