梅花实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选方法和应用技术

本发明专利技术公开了GAPDH、UBQ、Actin7、PP2A和Actin1基因作为内参基因及其专用引物在梅花实时荧光定量PCR分析中的应用；本发明专利技术还公开了一种梅花实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选方法，可为梅花分子水平研究研究提供理论基础和技术保障。基础和技术保障。基础和技术保障。

【技术实现步骤摘要】
梅花实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选方法和应用


[0001]本专利技术涉及园林植物分子生物学领域，特别是涉及梅花实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选方法和应用。

技术介绍

[0002]梅花(prunus mume)是蔷薇科李属多年生木本植物，原产于中国南方，已有三千多年栽培历史，是著名的观赏树种。随着梅花基因组测序以及分子研究的不断深入，选择出合适的内参基因为进一步研究梅花的重要农艺性状形成以及分子育种提供重要的保障。
[0003]实时荧光定量PCR(real time fluorescence quantitative PCR，qRT
‑
PCR)因具有准确性高、灵敏度高、特异性强、检测范围广等特点，其对于基因表达、分子水平的研究具有重大的意义，成为现代分子研究的重要手段。但实时定量PCR的结果受到总RNA质量、引物特异性和扩增效率等因素的影响，需要引入内参基因对基因表达进行校正，所以适合的内参基因显得格外的重要。理想的内参基因在任何生理状态下均能稳定地表达，然而现在没有任何一个基因能够满足要求。常用的内参基因包括转录延伸因子编码基因EF1α(elongation factor 1
‑
α)、3
‑
磷酸脱氢酶GAPDH(Glyceraldehyde
‑3‑
phosphate dehydrogenase)、α微管蛋白TUA(α
‑
tubulin)、β微管蛋白TUB(β
‑
tubulin)、肌动蛋白ACT(Actin)、多聚泛素酶基因UBQ(polyubiquitin)等被广泛应用于植物研究中。同时一些新的内参基因在不同条件下表现出高稳定性，比如蛋白磷酸酶PP2A(protein phosphatase 2A)，细胞色素P450同工酶CYP(Cytochrome P450 proteins)和真核细胞翻译起始因子EIF5A(eukaryotic initiation factor 5A)等。然而目前的内参基因在不同品种、组织和开花时期中可能出现表达水平的变化。因此选择内参基因要覆盖广泛的表达水平，具有在某一条件下的代表性。内参基因的选择不是固定的，是会随着实验材料和处理条件变化而变化，不能盲目以一种看家基因(houskeeping gene)作为任何实验条件下的内参。因此利用qRT
‑
PCR筛选不同品种、组织和不同开花时期的最佳内参基因势在必行。

技术实现思路

[0004]本专利技术要解决的技术问题是提供一种梅花实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选和应用，筛选梅花适用的qRT
‑
PCR内参基因，可为梅花分子水平研究提供理论基础和技术保障。
[0005]GAPDH、UBQ、Actin7、PP2A和Actin1基因作为内参基因在梅花实时荧光定量PCR分析中的应用；
[0006]在梅花不同品种的叶片间分析时，采用GAPDH和UBQ基因作为内参基因；
[0007]在梅花不同品种的花瓣间分析时，采用GAPDH和Actin1基因作为内参基因；
[0008]在
‘
美人
’
梅不同组织中分析时，采用Actin7和UBQ基因作为内参基因；
[0009]在
‘
美人
’
梅不同开花时期中分析时，采用PP2A和Actin1基因作为内参基因。
[0010]本专利技术所述的应用，其中，所述GAPDH的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，
所述UBQ的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示，所述Actin7的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所示，所述PP2A的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示，所述Actin1的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.5所示。
[0011]一种用于扩增本专利技术所述的内参基因的专用引物，其中，所述GAPDH基因的引物序列如序列表中SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；所述UBQ基因的引物序列如序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示；所述Actin7基因的引物序列如序列表中SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示；所述PP2A基因的引物序列如序列表中SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示；所述Actin1基因的引物序列如序列表中SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示。
[0012]本专利技术所述的专用引物在梅花实时荧光定量PCR分析中的应用。
[0013]一种梅花实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选方法，包括如下步骤：
[0014](1)材料准备：选取生长一致、无病虫害的梅花品种
‘
长艳宫粉
’
、
‘
北京玉蝶
’
、
‘
美人
’
梅、
‘
骨红朱砂
’
、
‘
淡丰后
’
、
‘
江梅垂枝
’
的叶片；选取
‘
美人
’
梅一年生枝条、多年生枝条、幼叶、成熟叶、盛花期的花瓣，同时采集
‘
美人
’
梅花发育四个不同时期的样品，包括小蕾期、大蕾期、初开期、盛开期，每组样品3个生物学重复，所有样品收集后液氮速冻，放置于－80℃冰箱保存备用；
[0015](2)总RNA提取和cDNA的合成；
[0016](3)候选内参基因的选择和引物设计，其中，候选内参基因为从梅花基因组数据库中筛选出的EF1α、GAPDH、Actin1、Actin2、Actin3、Actin7、UBQ、PP2A、TUA、TUB1、TUB2、TUB3、TUB4、PHK共14个候选内参基因序列；
[0017](4)qRT
‑
PCR分析；
[0018](5)实验数据处理与分析；
[0019](6)内参基因验证：在梅花不同品种的叶片和花瓣中，选择原血红素IX法尼基转移酶基因COX10和花青素还原酶基因ANR作为目的基因，在
‘
美人
’
梅不同组织和开花时期分别选用纤维素合成酶基因CESE1和扩展蛋白A20基因Expansin
‑
A20作为目的基因，选择稳定性好的两个内参基因和稳定性最差的一个基因，观察目的基因的表达模式，对内参表达稳定性的排序结果的可靠性进行验证；如稳定性好的内参基因与目的基因表达模式一致，稳定性差的基因与目的基因表达模式不一致，则说明内参表达稳定性的排序结果可靠。
[0020]本专利技术所述的梅花实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选方法，其中，步骤(4)中，反应体系如下：cDNA模板1.0μL，上下游引物各0.4μL，TB GREEN Premix Ex Taq(Tli RNa本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.GAPDH、UBQ、Actin7、PP2A和Actin1基因作为内参基因在梅花实时荧光定量PCR分析中的应用；在梅花不同品种的叶片间分析时，采用GAPDH和UBQ基因作为内参基因；在梅花不同品种的花瓣间分析时，采用GAPDH和Actin1基因作为内参基因；在
‘
美人
’
梅不同组织中分析时，采用Actin7和UBQ基因作为内参基因；在
‘
美人
’
梅不同开花时期中分析时，采用PP2A和Actin1基因作为内参基因。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述GAPDH的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，所述UBQ的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示，所述Actin7的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所示，所述PP2A的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示，所述Actin1的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.5所示。3.一种用于扩增权利要求1所述的内参基因的专用引物，其特征在于：所述GAPDH基因的引物序列如序列表中SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；所述UBQ基因的引物序列如序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示；所述Actin7基因的引物序列如序列表中SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示；所述PP2A基因的引物序列如序列表中SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示；所述Actin1基因的引物序列如序列表中SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示。4.权利要求3所述的专用引物在梅花实时荧光定量PCR分析中的应用。5.一种梅花实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)材料准备：选取生长一致、无病虫害的梅花品种
‘
长艳宫粉
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、
‘
北京玉蝶
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、
‘
美人
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梅、
‘
骨红朱砂
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、
‘
淡丰后
’
、
‘
江梅垂枝
’
的叶片；选取
‘
美人
’
梅一年生枝条、多年生枝条、幼叶、成熟叶、盛...

【专利技术属性】
技术研发人员：董彬，赵宏波，叶勇，王艺光，杨丽媛，肖政，钟诗蔚，方遒，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：