杜鹃根腐病病原菌的特异性检测靶标Ppini_05588及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种引起杜鹃根腐病的病原菌Phytophthora pini的特异性检测靶标Ppini_05588，该检测靶标Ppini_05588的DNA序列如SEQ ID NO：1所示，CDS序列如SEQ ID NO:1所示，蛋白序列如SEQ ID NO：2所示。同时，还公开了特异性检测靶标Ppini_05588的引物对，其正向引物序列如SEQ ID NO：3所示，反向引物序列如SEQ ID NO：4所示。本发明专利技术所发掘的检测靶标和其设计的引物对用于普通PCR，其特异性强，灵敏度高，为杜鹃根腐病的病原菌P.pini的检测提供了新的技术方法。技术方法。技术方法。

【技术实现步骤摘要】
杜鹃根腐病病原菌的特异性检测靶标Ppini_05588及应用


[0001]本专利技术属于杜鹃根腐病病原菌检测
，具体涉及杜鹃根腐病病原菌Phytophthora pini的特异性检测靶标Ppini_05588及应用。

技术介绍

[0002]Phytophthora pini是一种重要的卵菌植物病原体，P.pini能够引起杜鹃根部的腐烂以及枝干溃疡。目前已发现P.pini能在杜鹃、挪威云杉、杨树、欧洲山毛榉树、橄榄树等植物上致病。目前对该病还没有有效的防治措施，防止病原菌的传播扩散是控制该病的最有效措施。因此为了更有效地检测该病菌，建立快速检测方法，为病害的风险及研究决策提供依据，从而有利于降低该病害的发生对生态环境的保护起到一定的作用。
[0003]传统的卵菌分类鉴定主要是基于形态学特征、致病性测定、生理生化特征等。传统的分离疫腐霉的方法采是用诱捕法从土壤、灌溉水和植物材料中分离。传统方法在疫霉菌的检测中发挥了重要作用，但是费时费力而且要求操作者具备专业的疫霉菌分离、形态学鉴定知识和丰富的经验；同时传统分类鉴定方法耗时长、灵敏度低、易受人为及环境等诸多因素的干扰，不能在病害潜伏期和发病初期做出诊断，很难对病害发生进行及时的监测和有效控制。所以为了快速并准确的检测到病原菌，发掘特异性好的靶基因是目前所有检测技术的核心。不同的靶标序列检测的特异性和灵敏度存在一定的差距，因选择的目标靶序列不同、片段大小不同，结果都会有很大差别。靶标基因的选择要确保其在种内的不同菌株间的高度保守，而在种间变异性较高。
[0004]综上所述，发掘高信赖度特异性分子检测靶标并基于新靶标建立灵敏、准确的检测技术体系对提升对杜鹃根腐病病原菌P.pini的快速分子检测研究及其检测时所致病害早期诊断具有重要作用。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中的技术问题，本专利技术提供一种杜鹃根腐病病原菌P.pi ni的检测靶标Ppini_05588及基于新检测靶标其PCR检测引物组合物。本专利技术的另一目的是提供上述杜鹃根腐病病原菌P.pini的PCR检测试剂盒。
[0006]第一方面，本专利技术提供了一种引起杜鹃根腐病病原菌P.pini的特异性检测靶标Ppini_05588，所述检测标靶的DNA序列如SEQ ID NO：1所示。
[0007]第二方面，本专利技术提供了一种检测杜鹃根腐病病原菌P.pini的引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物Ppi05588 PCR
‑
F1序列如SEQ ID NO：3所示，反向引物Ppi05588 PCR
‑
R1序列如SEQ ID NO：4所示。
[0008]第三方面，本专利技术提供了第二方面所述的引物对在检测杜鹃根腐病病原菌P.pini中的应用。
[0009]第四方面，本专利技术还提供了一种检测杜鹃根腐病病原菌P.pini的试剂盒，至少包括1次用量的含有本专利技术第二方面所述的引物对的检测溶液，其中所述引物组合浓度为20μ
M。
[0010]进一步地，所述检测溶液还包括：4种dNTP各2000μM，100μL 10
×
PCR反应缓冲液，80mM Mg
2+
，100μL 1％BSA，50单位Taq酶。
[0011]第五方面，本专利技术还提供了第四方面所述的试剂盒在检测杜鹃根腐病病原菌P.pini中的应用。
[0012]第六方面，本专利技术还提供了一种检测杜鹃根腐病病原菌P.pini的方法，包括以下步骤：取1μL检测对象的DNA溶液，加入23μL本专利技术第四方面中所述的检测溶液和1μL灭菌去离子水，总体积为25μL；PCR扩增程序为94℃变性3分钟，94℃变性30秒钟；58℃退火30秒；72℃延伸45秒钟；33个循环，最后72℃延伸10分钟。
[0013]相比于现有技术，本专利技术的优点为：
[0014]1)本专利技术首次公开了高信赖度特异性分子检测靶标Ppini_05588，并基于该新靶标建立灵敏、准确PCR检测技术体系，对提升对杜鹃根腐病病原菌P.pini的快速分子检测研究及其检测时所致病害早期诊断具有重要作用。
[0015]2)采用本专利技术提供的检测引物对针对杜鹃根腐病病原菌P.pini菌株和其他镰刀菌、真菌以及松材线虫、病原卵菌等进行检测，结果显示仅有杜鹃根腐病病原菌P.pini的检测结果为阳性，能够扩增出特异性条带，条带大小为247bp；同时，经过特异性实验证明，PCR法检测杜鹃根腐病病原菌P.pini基因组DNA的灵敏度为100pgμL
‑1。
[0016]3)本专利技术为杜鹃根腐病病原菌P.pini的检测提供了新的检测靶标的发掘方法和技术平台，在病害侵染初期鉴定出病原物，本专利技术可以用于带菌植株组织中杜鹃根腐病病原菌P.pini的快速检测，能够对感病样品进行快速检测。
附图说明
[0017]为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0018]图1是基于杜鹃根腐病病原菌P.pini新检测靶标Ppini_05588设计的特异性引物Ppi05588PCR
‑
F1/Ppi05588PCR
‑
R1在疫霉菌种间普通PCR特异性验证电泳图；特异性引物上游引物Ppi05588 PCR
‑
F1和下游引物Ppi05588PCR
‑
R1只能从供试的杜鹃根腐病病原菌P.pini菌株中特异地扩增出一条247bp的条带，而其余疫霉未产生目的条带；其中，从左边到右边，依次为：1，Marker；2，杜鹃根腐病病原菌Phytophthorapini；3，辣椒疫霉Phytophthora capsici；4，烟草疫霉Phytophthora nicotianae；5，大豆疫霉Phytophthora sojae；6，柑桔褐腐疫霉Phytophthora citrophthora；7，荔枝疫霉Phytophthora litchii；8，大雄疫霉Phytophthora megasperma；9，寄生疫霉Phytophthora parasitica；10，冬生疫霉Phytophthora hibernalis；11，丁香疫霉Phytophthora syringae；12，N阴性对照；13，Marker。
[0019]图2是基于杜鹃根腐病病原菌P.pini新检测靶标Ppini_05588设计的特异性引物在其他卵菌和真菌中的普通PCR特异性验证电泳图；特异性引物上游引物Ppi05588 PCR
‑
F1和下游引物Ppi05588 PCR
‑
R1只能从供试的杜鹃根腐病病原菌P.pini菌株中特异地扩增出一条247bp的条带，而其余卵菌或真菌未产生目的条带；
[0020]图3是实施例3基于杜鹃根腐病病原菌P.pini新检测靶标Ppini_05588设计的检测
引物组合的灵敏度验证电泳图，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种引起杜鹃根腐病病原菌P.pini的特异性检测靶标Ppini_05588，其特征在于，所述检测标靶的DNA序列如SEQ ID NO：1所示。2.一种检测杜鹃根腐病病原菌P.pini的引物对，其特征在于，所述引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物Ppi05588 PCR
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F1序列如SEQ ID NO：3所示，反向引物Ppi05588 PCR
‑
R1序列如SEQ ID NO：4所示。3.权利要求2所述的引物对在检测杜鹃根腐病病原菌P.pini中的应用。4.一种检测杜鹃根腐病病原菌P.pini的试剂盒，其特征在于，至少包括1次用量的含有权利要求3所述的引物对的检测溶液，其中所述引物组合浓度为20μM。5....

【专利技术属性】
技术研发人员：戴婷婷，周紫薇，杨静，钱茱希，吴翠萍，
申请(专利权)人：南京海关动植物与食品检测中心，
类型：发明
国别省市：