一种羧酯酶、编码基因、基因工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术涉及及一种羧酯酶及其编码基因，以及由该编码基因构建的基因工程，以及其在微生物催化制备S

【技术实现步骤摘要】
一种羧酯酶、编码基因、基因工程菌及其应用


[0001]本专利技术涉及一种羧酯酶及其编码基因，以及由该编码基因构建的基因工程，以及其在微生物催化制备S
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萘普生中的应用。

技术介绍

[0002]萘普生（6
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甲氧基
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α
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甲基
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萘乙酸）是一类具有抗炎、抗风湿、解热镇痛作用的非甾体类抗炎药。萘普生有两种构型，其中S
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萘普生是R
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萘普生活性的28倍，制备光学纯萘普生能在提高药效的同时降低其临床风险性。传统的S
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萘普生合成以化学法为主，化学法工艺复杂且手性催化剂价格昂贵，易对环境造成巨大的污染。相比之下采用酶法水解拆分制备S
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萘普生具有的反应条件温和，工艺流程简单，对环境友好等优点，使得生物酶法越来越受到重视。
[0003]据辛嘉英等研究，在水
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离子液体两相体系中（中国ZL 03152790.6），应用脂肪酶柱状酵母L
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1754进行萘普生甲酯的水解在底物加量为75 mg/mL转化率为38.13 %，光学纯度为97.67 %。许建和团队采用高速匀浆（中国ZL 2010114462.8）的方法将制备的含有40 g/L萘普生甲酯悬浮浆液与羧酯酶粗酶进行反应转化率为39.8%。据李海艳（学术论文，哈尔滨商业大学，2016）报道采用褶皱假丝酵母脂肪酶在萘普生甲酯加量为10 g/L时，反应3 h转化率>20 %，光学纯度为98 %。

技术实现思路

[0004]针对现有技术中的问题，本专利技术提供一种分离自某传统蚕豆酱酿造工厂的酱曲样品0305宏基因组DNA的羧酯酶及其编码基因，以及由该编码基因构建的基因工程，以及其在微生物催化制备S
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萘普生中的应用。
[0005]本专利技术采用的技术方案是：一种羧酯酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本专利技术构建并筛选了四种不同来源的酯酶，分别来源于实验室常用的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌株168、分离自土壤样品的菌株B. subtilis IFE602、安徽某传统蚕豆酱酿造工厂的酱曲样品0305宏基因组DNA和某公司生物肥料样品B501宏基因组DNA，其中来自酱曲样品0305宏基因组DNA的羧酯酶活性最高，即本专利技术羧酯酶，该羧酯酶以大肠杆菌为宿主进行异源表达，用于选择性拆分(R，S)
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萘普生甲酯制备S
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萘普生，具有高催化效率和高选择性的特点。
[0006]本专利技术还涉及编码所述的羧酯酶的基因。
[0007]具体的，所述编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]本专利技术还涉及含有所述编码基因的重组载体。
[0009]本专利技术还涉及含有所述编码基因的基因工程菌。
[0010]具体的，所述工程菌按如下方法构建获得：将SEQ ID NO.1所示的羧酯酶基因克隆到pET28a质粒上，构建pET28a
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cesA0305重组表达质粒，并转化到大肠杆菌E. coli BL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3) (pET28a
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cesA0305)，即所述基因工程菌。
[0011]本专利技术还涉及所述基因工程菌在微生物催化制备S
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萘普生中的应用。
[0012]具体的，所述应用为：以所述基因工程菌经发酵培养获得的发酵液、发酵液离心后的湿菌体（湿菌体添加量30~70 g/L，60 g/L）与缓冲液或去离子水的菌悬液或菌悬液破碎液为催化剂，以（R,S）
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萘普生甲酯为底物（添加量150~250 g/L，优选200 g/L），并加入辅助剂，在30~45℃、pH为6.0~8.0的条件下进行反应，获得含S
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萘普生的反应液，反应液经分离纯化得到所述S
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萘普生；所述辅助剂为下列之一：PEG20000，石油醚，正庚烷，吐温
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20，Span80，PEG2000，异辛烷，正丁醇，异丙醇。优选的，所述辅助剂为异辛烷。
[0013]本专利技术的有益效果主要体现在：本专利技术提供了一种羧酯酶及其编码基因，利用该基因构建工程菌进行酶法立体选择性催化生产S
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萘普生，具有时空产率高，效果稳定的特点，在较短时间内可以获得转化效率可达到48 %以上，光学纯度可达到99 %以上，对实现高产量高纯度的S
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萘普生生产具有重要意义。
附图说明
[0014]图1为萘普生的分子结构式。
[0015]图2为pET28a
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cesA
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0305质粒图。
[0016]图3为4种羧酯酶基因的序列比对图。
[0017]图4为萘普生甲酯的HPLC分析图谱。
[0018]图5为萘普生的HPLC分析图谱。
[0019]图6为羧酯酶0305催化液的HPLC分析图谱。
具体实施方式
[0020]下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此：本专利技术实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。
[0021]种子培养基组成：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，溶剂为去离子水，pH=6.8~7.0。
[0022]发酵培养基组成：酵母粉12 g/L，蛋白胨15 g/L，甘油10 g/L，Na2HPO4·
12H2O 8.9 g/L，KH2PO
4 3.4 g/L，NH4Cl 2.67 g/L，Na2SO4 0.71 g/L，MgSO4·
7H2O 0.3 g/L，溶剂为去离子水，pH=6.8
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7.0。
[0023]实施例1：四种含羧酯酶基因的重组大肠杆菌的构建（1）羧酯酶基因扩增以实验室常用的枯草芽孢杆菌菌株168的基因组DNA、分离自土壤样品的保藏菌株B. subtilis IFE602的基因组DNA、安徽某传统蚕豆酱酿造工厂的酱曲样品0305宏基因组DNA、某公司生物肥料样品B501宏基因组DNA为DNA模板，以cesA
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NdeI
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F/cesA
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R为扩增引物，采用南京诺唯赞生物科技有限公司的高保真酶Phanta Max Super
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Fidelity DNA Polymerase进行PCR扩增得到一系列羧酯酶基因其PCR扩增程序为：95 ℃，3 min；95 ℃，15 s；53 ℃，15 s；72 ℃，3 min；30个循环；72 ℃，5 min；4 ℃保存。用DNA胶回收试剂盒进行PCR产物纯化。
[0024]cesA
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NdeI
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F：5
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种羧酯酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.编码权利要求1所述的羧酯酶的基因。3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。4.含有权利要求2所述编码基因的重组载体。5.含有权利要求2所述编码基因的基因工程菌。6.如权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于所述工程菌按如下方法构建获得：将SEQ ID NO.1所示的羧酯酶基因克隆到pET28a质粒上，构建pET28a
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cesA0305重组表达质粒，并转化到大肠杆菌E. coli BL21（DE3）中，得到重组大肠杆菌E.coli BL21（DE3） （pET28a
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cesA0305），即所述基因工程菌。7.权利要求5所述基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈小龙，陈晓婷，朱林江，陆跃乐，陈翰驰，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：