用于制备褐藻寡糖的褐藻胶裂解酶及其用途制造技术

本发明专利技术通过筛选来源于爱媛类芽孢杆菌(Paenibacillus ehimensis)中的酶基因，经重组获得一种具有褐藻胶裂解的酶活力的蛋白质，由此，本发明专利技术提供了由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的蛋白质用作褐藻胶裂解酶的用途及其应用。本发明专利技术人发现，该褐藻胶裂解酶相比现有技术具有更高的酶活力、良好的耐热性和优异的产糖性能，能够在短时间内降解大量海藻酸钠，并且生产成本低，所用设备少，具备工业规模化生产的潜力。生产的潜力。生产的潜力。

【技术实现步骤摘要】
用于制备褐藻寡糖的褐藻胶裂解酶及其用途


[0001]本专利技术涉及生物酶领域，具体地涉及一种用于酶解褐藻酸盐以制备褐藻寡糖的褐藻胶裂解酶。

技术介绍

[0002]海藻酸钠，又名褐藻酸钠，最初自褐藻类生物生成的褐藻胶中提取，在工业中通常由β
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D
‑
甘露糖醛酸(β
‑
D
‑
mannuronic acid，M)和α
‑
L
‑
古罗糖醛酸(α
‑
L
‑
guluronic acid，G)通过1,4
‑
糖苷键聚合而成的一种聚合物。在食品工业中具有增稠、凝胶、稳定体系等多种用途。褐藻寡糖(AOS,Alginate Oligosaccharides)是一种聚合度在2
‑
10的分子，由褐藻胶分解而成，具有调节人体免疫、抗氧化、抗肿瘤、保护神经系统、促进植物生长、抑菌等多种功能。AOS因具有特殊的化学特性和生物特性，在农业、食品、药品、保健品、化妆品、冶金、化工等领域具有潜在、广泛的应用价值。目前，褐藻胶的分解方法包括化学分解法、物理分解法和生物酶法，其中由于通过褐藻胶裂解酶的生物酶法的反应副产物少、耗能低且能生成含有不饱和双键的高生物活性寡糖，具有环保、清洁、条件温和、效率高等优点，其取代物理化学法称为制备AOS的主流方法已是必然。
[0003]迄今为止，尽管国内外学者对褐藻胶裂解酶的来源、分类、酶学性质、酶的结构、酶催化机理等方面作了大量的基础研究，但现有技术的褐藻胶裂解酶仍存在发酵水平低、酶活力不高、价格昂贵、且不适合大规模使用等问题。国际市场上只有美国Sigma公司商业化的褐藻胶裂解酶产品A1603
‑
100MG，酶活力大于10000U/g，但价格昂贵，仅以试剂形式出售。
[0004]因此，本领域仍需要一种酶活力高且成本低廉的褐藻胶裂解酶。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种酶活力高、耐热性好且具有改善的产糖能力的褐藻胶裂解酶以及应用。本专利技术的褐藻胶裂解酶制备方法简单、使用设备少，具有工业规模化生产的潜力。
[0006]本专利技术的专利技术人在NCBI库中筛选出一种源于爱媛类芽孢杆菌(Paenibacillus ehimensis)的蛋白(蛋白序列登录号为WP_127487869.1)，合成该蛋白并经试验发现该蛋白质具有优异的褐藻胶降解活性。由此，完成本专利技术。
[0007]在第一方面，本专利技术提供了具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质用作褐藻胶裂解酶的用途。
[0008]在第二方面，本专利技术提供了一种由褐藻酸盐酶解制备褐藻寡糖的方法，包括以下步骤：使包含作为褐藻胶裂解酶的具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质和褐藻酸盐的反应体系在45℃至65℃的温度反应。
[0009]综上，本专利技术提供一种褐藻胶裂解酶及其用于生产褐藻寡糖的用途，相比现有技术，本专利技术的褐藻胶裂解酶具有更高的酶活力、良好的耐热性和优异的产糖性能，能够在短时间内降解大量海藻酸钠，并且生产成本低，所用设备少，具备工业规模化生产的潜力。
附图说明
[0010]得益于以下具体实施方式以及参考附图，本专利技术的技术方案和益处对本领域技术人员会变得显而易见。
[0011]图1示出了根据本专利技术的一个实施方案得到的经纯化的褐藻胶裂解酶的电泳图，其中，M：Marker；1
‑
5泳道：诱导时间分别为0、4、8、16、24h的发酵上清；6泳道：纯化前粗酶液；7泳道：纯化后得到的paeh酶液。
[0012]图2示出了根据本专利技术的一个实施方案得到的褐藻胶裂解酶在45℃温度随时间的相对酶活变化。
[0013]图3示出了根据本专利技术的一个实施方案得到的褐藻胶裂解酶分别在50℃和55℃温度随时间的相对酶活变化。
[0014]图4示出了根据本专利技术的一个实施方案得到的褐藻胶裂解酶随温度(20℃至85℃)的相对酶活变化。
[0015]图5示出了根据本专利技术的一个实施方案得到的褐藻胶裂解酶随pH(pH 5至pH 10.5)的相对酶活变化。
[0016]图6示出了根据本专利技术的一个实施方案得到的褐藻胶裂解酶的裂解产物的质谱图。
具体实施方式
[0017]下面对本专利技术进行详细的描述。需理解，以下描述仅以示例方式来对本专利技术进行说明，无意于对本专利技术的范围进行限制，本专利技术的保护范围以随附权利要求为准。并且，本领域技术人员理解，在不背离本专利技术的精神和主旨的情况下，可以对本专利技术技术方案进行修改。
[0018]如
技术介绍
部分所描述，现有的褐藻胶裂解酶存在各种各样的问题，例如发酵水平低、酶活力不高，并且现有的商用褐藻胶裂解酶的价格昂贵。针对上述问题，本专利技术的目的在于提供一种高酶活力、高产糖量、且成本低廉的褐藻胶裂解酶及其应用。
[0019]如前所述，本专利技术的专利技术人在NCBI库中筛选出一种源于爱媛类芽孢杆菌(Paenibacillus ehimensis)的蛋白(SEQ ID NO：1)(蛋白序列登录号为WP_127487869.1)，合成该蛋白并经试验发现该蛋白具有优异的褐藻胶降解活性，是目前已发现的PL31家族的第二例褐藻胶降解酶。
[0020]在第一方面，本专利技术提供了具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质用作褐藻胶裂解酶的用途。
[0021]在一个具体的实施方案中，所述蛋白质由SEQ ID NO:2所示的核酸序列编码。
[0022]在一个具体的实施方案中，所述蛋白质是通过重组表达获得的，例如在大肠杆菌表达载体pET
‑
22b(+)中进行重组表达，但不限于此。所述重组表达是通过本领域技术人员熟知的方式进行，例如可以通过以下步骤进行：
[0023](1)重组质粒构建：合成例如SEQ ID NO：2所示的基因序列，在合成过程中可以将亲和标签(例如6个组氨酸标签)添加到目的基因片段的C末端，以配合后续对蛋白质的的分离纯化，例如Ni
2+
亲和层析分离纯化，并且该片段中含有Nde I和Xho I酶切位点的编码序列；将该片段中插入经Nde I和Xho I酶切过的大肠杆菌表达载体pET
‑
22b(+)中，获得重组
质粒。上述方法可以通过本领域熟知的方法进行，并不限于此。
[0024](2)工程菌构建：将所述重组质粒转入诸如大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞中，得到重组工程菌，这可以通过本领域技术人员熟知的方式，例如热激转化法，但不限于此。
[0025](3)表达诱导：从重组工程菌中挑取单菌落在培养基中进行培养，并通过添加表达诱导剂如异丙基
‑
β
‑
d
‑
硫代半乳糖苷(IPTG)来诱导该重组工程菌来表达目标蛋白；本领域技术人员可以根据实际需要选择合适的培养基、添加剂和合适的培养温度，这里并无特别限制。
[本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质用作褐藻胶裂解酶的用途。2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述蛋白质由SEQ ID NO:2所示的核酸序列编码。3.根据权利要求1或2所述的用途，其中，所述蛋白质是通过重组表达获得的，例如所述蛋白质为存在于重组细菌如大肠杆菌的全细胞培养液中的形式。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的用途，其中，所述蛋白质作为褐藻胶裂解酶的酶活力为120U/mg至130U/mg，例如为125.7U/mg。5.一种由褐藻酸盐酶解制备褐藻寡糖的方法，包括以下步骤：使包含作为褐藻胶裂解酶的具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质和褐藻酸盐的反应体系在45℃至65℃、优选为50℃至60℃、更优选为45℃至55℃的温度反应例如至少3小时、优选至少5小时、例如6
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8小时。6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述褐藻胶裂解酶在反应体系中的浓度为3μg/mL至5μg/mL，优选为4μg/mL；并且其中，所述褐藻酸盐在反应体系中的浓度以重量计为0.3％至0....

【专利技术属性】
技术研发人员：权利要求书一页说明书七页序列表二页附图四页，
申请(专利权)人：山东海之宝海洋科技有限公司，
类型：发明
国别省市：